常山酮對(duì)樹突狀細(xì)胞成熟的影響及其在大鼠同種異體心臟移植免疫耐受中的作用

胡玲，劉莉

（1.河南省南陽市中心醫(yī)院心臟大血管外科，河南南陽473009；2.南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)部，江蘇南京211167）

常山酮對(duì)樹突狀細(xì)胞成熟的影響及其在大鼠同種異體心臟移植免疫耐受中的作用

胡玲1，劉莉2

（1.河南省南陽市中心醫(yī)院心臟大血管外科，河南南陽473009；2.南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)部，江蘇南京211167）

目的觀察常山酮對(duì)樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC）成熟的影響，及其在大鼠同種異體心臟移植中的免疫耐受作用，以期進(jìn)一步了解常山酮的免疫調(diào)節(jié)作用，為移植免疫耐受提供新的方法和手段并探討其可能的機(jī)制。方法培養(yǎng)大鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)觀察HF對(duì)LPS刺激誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞成熟的影響；建立大鼠心臟移植模型，通過病理切片分析以及混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)觀察常山酮刺激后的樹突狀細(xì)胞對(duì)其免疫耐受的影響。結(jié)果流式檢測(cè)結(jié)果表明：對(duì)照組細(xì)胞表面CD80、CD86、OX62抗原的表達(dá)量不高；應(yīng)用LPS刺激24h之后，CD80、CD86、OX62的表達(dá)量明顯增加；常山酮和LPS共同刺激24h之后，CD80、CD86、OX62的表達(dá)量低于空白組，說明常山酮具有抑制LPS誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞成熟的能力。在大鼠心臟移植模型中，常山酮刺激的樹突狀細(xì)胞注射入受體大鼠體內(nèi)后，受體大鼠的移植排斥明顯降低，說明常山酮刺激后的樹突狀細(xì)胞可能作為一種新的細(xì)胞治療手段用于治療移植排斥。結(jié)論常山酮可抑制大鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞的成熟；常山酮刺激的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)免疫排斥的能力下降，常山酮刺激后的樹突狀細(xì)胞具有抑制淋巴細(xì)胞增殖的能力。

常山酮；樹突狀細(xì)胞；心臟移植；免疫耐受

目前對(duì)于移植術(shù)后的免疫排斥，常用手段是使用免疫抑制劑，但是長期應(yīng)用非特異性免疫抑制劑會(huì)造成顯著的并發(fā)癥發(fā)生率和死亡率，特別是引起感染和惡性腫瘤易感性的升高［1］，仍然是器官移植領(lǐng)域所面臨和亟待解決的難題。

常山酮（halofuginone，HF）是一種近年來被廣泛研究的退熱堿。常山酮對(duì)于Th17細(xì)胞的活性有一定的調(diào)節(jié)作用，可以通過激活細(xì)胞保護(hù)性的信號(hào)通路來選擇性地抑制人和鼠Th17細(xì)胞的分化［1］。也可以通過激活核酸饑餓反應(yīng)（amino acid starvation response，AAR）來阻止Th-17引起的自身免疫［2］。Leiba M等［3］研究發(fā)現(xiàn)，常山酮可以抑制效應(yīng)T細(xì)胞中的NF-kappaB和p38MAPK通路。這2條通路已被證實(shí)是與免疫應(yīng)答的激活有密切關(guān)系的［4-6］，說明常山酮對(duì)于免疫應(yīng)答的產(chǎn)生具有一定程度的影響作用。由于目前缺乏關(guān)于常山酮對(duì)樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞調(diào)節(jié)作用的報(bào)道，它是否能通過調(diào)節(jié)DC的活動(dòng)來影響Th細(xì)胞的激活，或者通過影響imDC的成熟來調(diào)節(jié)免疫排斥，或者通過其他途徑對(duì)機(jī)體的免疫反應(yīng)產(chǎn)生影響還不得而知［7-10］。

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察到：常山酮對(duì)于大鼠骨髓樹突狀細(xì)胞的成熟具有一定的抑制作用，因此本研究運(yùn)用常山酮刺激的供體大鼠骨髓樹突狀細(xì)胞，通過尾靜脈注射入受體大鼠體內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞治療，觀察其抗免疫排斥反應(yīng)的效果。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)采用了形態(tài)學(xué)檢測(cè)以及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠BMDC表面標(biāo)志物CD80、CD86、OX62的方法，對(duì)所培養(yǎng)的大鼠BMDC進(jìn)行綜合判斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器：細(xì)胞培養(yǎng)板（Coring公司）；5mL無菌注射器（湖北康友醫(yī)用器材有限公司）；EP管（君科生物科技有限公司）；離心管（君科生物科技有限公司）；SP-DJ系列垂直凈化工作臺(tái)（武漢格林美潔凈設(shè)備工程有限公司）；可調(diào)定量移液器（Corning公司）；Thermo Barnstead超純水儀（美國賽默飛公司）；MLs-3020型高壓消毒鍋（日本三洋公司）；ELX610電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（蘇州德瑞普烘箱制造有限公司）；TGL臺(tái)式離心機(jī)（上海賀默儀器科技有限公司）；低溫超速離心機(jī)（Sigma公司）；-80℃超低溫冰箱（日本三洋公司）；AE340型電子分析天平（上海賀默儀器科技有限公司）；FM80A制冰機(jī)（意大利Grant公司）；流式細(xì)胞儀Epic-XL（美國Beckmen Coulter公司）。

1.1.2 試劑：RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（Hyclone公司）；青霉素、鏈霉素（武漢藥業(yè)集團(tuán)）；rrGM-CSF、重組大鼠白細(xì)胞介素-4（rr IL-4）（美國R&D公司）；常山酮（Halofuginone，HF）（法國羅素·尤克福公司）；脂多糖（LPS）（Sigma公司）；CD80、CD86、OX62、FITC anti-ratCD80、PE anti-rat CD86、PE anti-rat OX62（美國eBioscience公司）；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康無熱源Wistar大鼠15只，6～8周齡，雄性，來自于武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于A3實(shí)驗(yàn)室，溫度為恒溫（23±2）℃，濕度為45%～65%，每天光照時(shí)間約12 h。飲食經(jīng)高壓滅菌。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證：No.4209800287。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組：15只大鼠隨機(jī)分成3組，每組5只，Control組大鼠在移植前7 d經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水；DC組注射未經(jīng)常山酮處理的樹突狀細(xì)胞；HF-DC組注射常山酮處理后的樹突狀細(xì)胞。

1.2.2 大鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)和分離：雄性Wistar大鼠頸椎脫臼法處死，用體積比75%酒精浸泡消毒10 min，無菌條件下取雙側(cè)股骨、脛骨，剝除附著肌肉，將骨暫存于體積比75%酒精中使肌蛋白溶解；用紗布包住骨，無菌條件下用紗布輕輕搓除剩余肌肉，剪去骨兩端，用PBS緩沖液洗滌兩遍；用5mL注射器抽取無血清RPMI1640培養(yǎng)液，反復(fù)沖洗至髓腔變白；收集細(xì)胞懸液至50mL離心管中，1 200 r/min離心，5min，去上清；按體積比1：20加入氯化銨紅細(xì)胞裂解液，室溫下輕輕吹打5min，1200 r/min離心，5min，去上清；用完全RPMI1640培養(yǎng)液重懸成細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，確保細(xì)胞濃度為（1～2）×106/mL；將細(xì)胞懸液接種培養(yǎng)瓶中，加入rrGM-CSF 20ug/mL，rm IL-4 10 ug/mL，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱；48 h后，輕蕩培養(yǎng)板，棄培養(yǎng)液（含懸浮細(xì)胞），并等量換液，觀察貼壁集落。

1.2.3 大鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞純度的鑒定：分別在培養(yǎng)第6日和第8日收集懸浮和半貼壁細(xì)胞，先進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，PBS洗滌2次，去上清，再用PBS重懸，分別加入PE或FITC標(biāo)記的CD80、CD86、OX62，同時(shí)設(shè)PE或FITC標(biāo)記的IgG抗體為陰性對(duì)照。4℃避光孵育30min，加入PBS至500 uL，后置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子CD80、CD86和OX62的表達(dá)。

1.2.4 大鼠心臟移植術(shù)后存活時(shí)間：以移植心臟能持續(xù)搏動(dòng)3 d為手術(shù)成功標(biāo)準(zhǔn)，并檢查每天移植心臟搏動(dòng)狀況。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠心臟移植術(shù)后存活時(shí)間進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，移植心臟停止搏動(dòng)即為存活終點(diǎn)。

1.2.5 移植心臟排斥反應(yīng)的病理學(xué)分級(jí)：大鼠移植心臟，于中、遠(yuǎn)1/3處橫斷面切片，HE染色。采用Stanford標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)移植心臟免疫排斥的程度進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS軟件，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定及常山酮對(duì)樹突狀細(xì)胞成熟的影響

2.1.1 大鼠骨髓樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)：本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的大鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞集落生長良好，炎性細(xì)胞較少（見圖1）。

圖1 大鼠骨髓樹突狀細(xì)胞集落圖Fig.1 Rat bonemarrow dendritic cell colony

2.1.2 大鼠BMDC純度的鑒定：細(xì)胞培養(yǎng)6 d離心后，經(jīng)流式檢測(cè)，表面標(biāo)志物CD80、CD86、OX62表達(dá)分別為83.2%、87.1%、62.8%（見圖2）

圖2 通過流式細(xì)胞術(shù)鑒定大鼠BM-DC純度Fig.2 By identifying the rat BM-DC flow cytometry purity

2.1.3 常山酮對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠骨髓樹突狀細(xì)胞表面抗原表達(dá)的影響：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，對(duì)照組細(xì)胞表面CD80、CD86、OX62抗原的表達(dá)量不高；應(yīng)用LPS刺激24 h之后，CD80、CD86、OX62的表達(dá)量明顯增加；常山酮和LPS共同刺激24 h之后，CD80、CD86、OX62的表達(dá)量甚至低于空白組，表明常山酮可以抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠骨髓樹突狀細(xì)胞表型的成熟（見圖3）。

圖3 通過流式細(xì)胞術(shù)觀察常山酮對(duì)大鼠骨髓樹突狀細(xì)胞表面抗原表達(dá)的影響Fig.3 Effect of Dichroa ketone on rat bonemarrow dendritic cell surface antigen expression

2.1.4 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)：HF刺激的DC相比其他2組能顯著抑制淋巴細(xì)胞增殖的功能（P＜0.001），經(jīng)過HF刺激的DC細(xì)胞，對(duì)于抑制淋巴細(xì)胞增殖能力與imDC相同（見圖4），說明了HF能抑制大鼠骨髓樹突狀細(xì)胞功能的成熟。

圖4 通過混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)觀察常山酮刺激的樹突狀細(xì)胞抑制淋巴細(xì)胞增殖的功能Fig.4 Inhibitition of dendritic cell stimulated by dichroa ketone on lymphocytes proliferation

2.2 大鼠心臟移植模型的建立以及常山酮刺激的樹突狀細(xì)胞對(duì)其免疫耐受的影響

2.2.1 大鼠心臟移植術(shù)后存活時(shí)間：一共15只移植術(shù)后大鼠，有4只在術(shù)后3 d內(nèi)死亡，其余存活時(shí)間都超過3 d，存活最長達(dá)到9 d。注射生理鹽水組大鼠平均存活時(shí)間為（5.8±1.1）d，注射未經(jīng)處理的DC組大鼠平均存活時(shí)間為（2.8±0.7）d，注射經(jīng)常山酮處理后的DC組大鼠平均存活時(shí)間為（7.4±0.9）d。Control組分別與DC組、HF-DC組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HF-DC組與DC組相比，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2.2 移植心排斥反應(yīng)的病理分級(jí)：由下圖可以看出，DC組大鼠供心發(fā)生了廣泛的炎性浸潤，分級(jí)為IIIB級(jí)；Control組有多灶性侵襲性淋巴細(xì)胞浸潤或伴有心肌細(xì)胞損害，分級(jí)為IIIA級(jí)；HF-DC組有少量散在的淋巴細(xì)胞浸潤，或者是有單灶性侵襲性淋巴細(xì)胞浸潤或伴有灶性心肌細(xì)胞損害，分級(jí)為 II級(jí)（見圖5）。

圖5 移植心臟病理切片F(xiàn)ig.5 Heart transplant pathology slice sheet cell colony

3 討論

近年來，普遍采用的大鼠心臟移植模型有2類，一類是大鼠頸部異位心臟移植［11］，一類是大鼠腹部異位心臟移植［12］。建立大鼠頸部異位心臟移植模型是一種簡(jiǎn)便快捷、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的技術(shù)，成功率高，并發(fā)癥少［13-14］，通過局部觸診，能敏銳、準(zhǔn)確地反應(yīng)移植物的病理生理變化過程，及時(shí)客觀地發(fā)現(xiàn)移植物被排斥或產(chǎn)生耐受的情況［15］。

通過統(tǒng)計(jì)移植心存活時(shí)間并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)一共15只移植術(shù)后大鼠，有4只在術(shù)后3 d內(nèi)死亡，其余存活時(shí)間都超過3 d，存活最長達(dá)到9 d。注射生理鹽水組大鼠平均存活時(shí)間為5.8天，注射未經(jīng)處理的DC組大鼠平均存活時(shí)間為2.8天，注射經(jīng)常山酮處理后的DC組大鼠平均存活時(shí)間為7.4天。Control組分別與DC組、HF-DC組相比，差異具有著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HF-DC組與DC組相比，差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。通過對(duì)移植心臟進(jìn)行病理切片并分級(jí)，發(fā)現(xiàn)DC組大鼠心肌細(xì)胞發(fā)生了廣泛的炎性浸潤，分級(jí)為IIIB級(jí)；Control有多灶性侵襲性淋巴細(xì)胞浸潤或伴有心肌細(xì)胞損害，分級(jí)為IIIA級(jí)；HF-DC組有少量散在的淋巴細(xì)胞浸潤，或者是有單灶性侵襲性淋巴細(xì)胞浸潤或伴有灶性心肌細(xì)胞損害，分級(jí)為II級(jí)。說明了HF刺激后的DC具有抑制移植免疫排斥的作用，也在研究如何對(duì)抗移植排斥的道路上前進(jìn)了一小步。

本實(shí)驗(yàn)成功地在體外培養(yǎng)并取得了大鼠骨髓樹突狀細(xì)胞（bonemarrow-derived dendritic cells，BMDCs），首次觀察到HF大鼠骨髓樹突狀細(xì)胞的成熟具有一定程度的影響，并且觀察了常山酮刺激的樹突狀細(xì)胞對(duì)于大鼠心臟移植免疫耐受的調(diào)節(jié)作用，結(jié)論如下：①常山酮具有抑制LPS誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞成熟的能力。這表明常山酮有可能通過調(diào)控樹突狀細(xì)胞的分化成熟過程，從而在某些與樹突狀細(xì)胞過度活化有關(guān)的免疫性疾病（例如自身免疫性疾?。┲校l(fā)揮可能的治療作用或稱為潛在的治療因子。②在大鼠心臟移植模型中，常山酮刺激的樹突狀細(xì)胞注射入受體大鼠體內(nèi)后，受體大鼠的移植排斥明顯降低，說明常山酮刺激后的樹突狀細(xì)胞可能作為一種新的細(xì)胞治療手段用于治療移植排斥。

［1］ Fishman JA，Rubin RH.Infection in organ-transplant recipients［J］.N Engl Med，1998，338(10）：1741-1751.

［2］Raimondi G，Thomson AW.Dendritic cells，tolerance and therapy of organ allograft rejection［J］.Contrib Nephrol.2005，146(1）：105-120.

［3］ Pêche H，TrinitéB，Martinet B，et al.Prolongation of heart allograft survival by immature dendritic cells generated from recipient type bone marrow progenitors［J］.Am JTransplant.2005，5(2）：255-267.

［4］Steinman RM，Cohn ZA.Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs ofmice.I.Morphology，quantitation，tissue distribution［J］. JExp Med，1973，137(11）：1142-1162.

［5］Xin H，Yang W，Wang Q，et al.Immune Tolerance of Skin Allograft Transplantation Induced by Immature Dendritic Cells of a Third Party Carrying Donor Antigens in Mice［J］.Transplant Proc，2013，45(2）：552-557.

［6］Tracy LK，Davide Z，Mark SS，etal.Halofuginone and other Febrifugine Derivatives Inhibit Prolyl-tRNA synthetase［J］.Nat Chem Biol，2012，8 (3）：311-317.

［7］Mark SS，Sergei BK，et al.Halofuginone Inhibits Th17 Cell Differentiation by Activating the Amino Acid Starvation Response［J］. Science，2009，324(5932）：1334-1338.

［8］Leiba M，Cahalon L，Shimoni A，et al.Halofuginone Inhibits NF-kappaB and p38 MAPK in Activated T Cells［J］.JLeukoc Biol，2006，80(2）：399-406.

［9］Resciqno M，Martino M，Sutherland CL，et al.Dendritic Cell Survival and Maturation Are Regulated by Different Signaling Pathways［J］.J Exp Med 1998，188(1）：2175-2180.

［10］O’Keeffe M，Hochrein H，Vremec D，et al.Effects of administration of progenipoietin 1，F(xiàn)It-3 ligand，granulocyte colony-stimulating factor，and pegylated granulocyte-macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell subsets in mice［J］.Blood，2002，99(2）：2122-2130.

［11］周光炎.免疫學(xué)原理［M］.上?？茖W(xué)技術(shù)出版社.2007.

［12］Bériou，Ga?lle，Pêche，et al.Donor-specific allograft tolerance by administration of recipient-derived immature dendritic cells and suboptimal immunosuppression［J］.Transplantation，2005，79(8）：969-972.

［13］Naik SH，Corcoran LM，Wu L.Development of murin plasmacytoid dendritic cell subsets［J］.Immunol Cell Biol，2005，83(13）：563-570.

［14］Wu L，Liu YJ.Development of dendritic-cell lineages［J］.2007，26 (6）：741-750.

［15］賀偉峰，吳軍，羅高興，等.大鼠樹突狀細(xì)胞的體外分離、純化、擴(kuò)增及鑒定［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，8(24）：879-881.

（編校：吳茜）

Effects of halofuginone on maturation of dendritic cells and immune tolerance during homograft heart transp lantation of rats

HU Ling1，LIU Li2

（1.Department of Cardiac Vascular Surgery，Nanyang Central Hospital，Nanyang 473009，China；2.Department of Medical Sciences，Medical University，Nanjing 211167，China）

ObjectiveTo explore the role ofhalofuginone in immune regulation，observe the effects ofhalofuginone onmaturation of dendritic cells and immune tolerance during homograft heart transplantation of rats，in order to provide new ways and means to treat transplantation tolerance and to explore its possiblemechanism.MethodsRat bonemarrow derived dendritic cellswere isolated and the effects of halofuginone in LPS-treated DCswere investigated by flow cytometry；heart transplantationmodel of ratswere established and the effectof halofuginone stimulated dendritic cells in the immune tolerance by pathological analysis and mixed lymphocyte reaction were observed.ResultsFlow cytometry results show that the expression of cell surface CD80 CD86，OX62 antigenswere nothigh in controlgroup，their expression increased significantlywhen stimulated by LPS for24h，and decreased when stimulated by both Changshan ketone and LPS for 24h，and even lower than their expression levels in blank group，which showed that Changshan ketone has the ability to inhibit thematuration of dendritic cells induced by LPS.In rat heart transplantation model，dendritic cells stimulated with Changshan were injected into recipient rats in vivo，and receptor of rat transplantation rejection decreased significantly，which showed that dendritic cells stimulated with Changshan ketonemay be used as a new method for cell therapy in treatmentof transplant rejection.ConclusionThis study systematically observes that halofuginone can inhibit thematuration of ratbonemarrow-derived dendritic cells and lymphocyte proliferation for the first time in vivo and in vitro.

shalofuginone；dendritic cells；heart transplantation；immune tolerance

R392.4

A

1005-1678(2014）07-0040-04

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81170321）

胡玲，女，本科學(xué)歷，研究方向：心臟大血管外科及體外循環(huán)，E-mail：qch18214600107@163.com。