舒林酸對人胰腺癌細(xì)胞PANC-1增殖和凋亡的影響及機(jī)制探討

卞保祥，宋子琰，熊光蘇

（1.徐州醫(yī)學(xué)院附屬連云港醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇連云港222002；2.上海交通大學(xué)臨床內(nèi)科，上海200240）

舒林酸對人胰腺癌細(xì)胞PANC-1增殖和凋亡的影響及機(jī)制探討

卞保祥1，宋子琰1，熊光蘇2

（1.徐州醫(yī)學(xué)院附屬連云港醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇連云港222002；2.上海交通大學(xué)臨床內(nèi)科，上海200240）

目的以人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1為研究對象，利用不同濃度舒林酸處理PANC-1細(xì)胞，觀察其對PANC-1細(xì)胞增殖、凋亡影響，并探討舒林酸通過抑制Wnt/β-catenin信號通路殺傷PANC-1細(xì)胞的可能機(jī)制。方法實(shí)驗(yàn)分為陰性對照組(加入不含舒林酸的DMSO）和實(shí)驗(yàn)組(分別加入舒林酸濃度為0.25、0.5、1、1.5、2mM的培養(yǎng)液，分別為：陰性對照組、0.25mM組、0.5mM組、1.0 mM組、1.5mM組、2.0mM組，總計(jì)6組）。MTT法檢測PANC-1細(xì)胞生長抑制率；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率；RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)β-Catenin的表達(dá)。結(jié)果MTT結(jié)果顯示：PANC-1細(xì)胞經(jīng)舒林酸干預(yù)后生長均受到不同程度抑制，且隨著舒林酸濃度增加，抑制作用越強(qiáng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡結(jié)果顯示PANC-1細(xì)胞早期凋亡率干預(yù)后均有不同程度增加，與對照組相比，0.5、1.0mM組早期凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而1.5、2.0mM組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。RT-PCR結(jié)果顯示可見各組β-catenin mRNA表達(dá)量隨著舒林酸濃度增加而降低，0.5、1.0mM組與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而1.5及2.0mM組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）；應(yīng)用2.0mM的舒林酸處理PANC-1細(xì)胞0、12、24、48、72 h，隨著處理時(shí)間延長，β-catenin mRNA表達(dá)量逐漸降低，各處理組與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。ICC結(jié)果證實(shí)干預(yù)后PANC-1細(xì)胞內(nèi)β-catenin表達(dá)量及核聚集降低，與對照組相比，0.25、0.5mM組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而1.0、1.5、2.0mM組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。結(jié)論舒林酸對PANC-1細(xì)胞具有生長抑制及促凋亡作用，這種作用具有濃度-時(shí)間依賴性，舒林酸抑制Wnt/β-catenin信號通路可能是其殺傷PANC-1細(xì)胞的可能機(jī)制之一。

舒林酸；人胰腺癌細(xì)胞PANC-1；Wnt/β-catenin信號通路；增殖及凋亡

胰腺癌（pancreatic carcinoma）是一類常見的消化系腫瘤［1］，40歲以上好發(fā)，男性比女性多見［2］，近年來隨著經(jīng)濟(jì)社會的發(fā)展，生活條件的改善和人口老齡化，其發(fā)病率逐年升高，死亡率幾乎等同于發(fā)病率，5年生存率僅1%～3%，患者長期生存情況較差［3］。世界上每年因胰腺癌而導(dǎo)致死亡的人數(shù)大約為25萬，其發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排13位，病死率在所有惡性腫瘤中居首位，約為98%，大多數(shù)病人發(fā)病時(shí)已處于晚期，主要治療方法包括手術(shù)、化療、放射性粒子植入、對癥支持治療等［4-5］。本研究旨在通過對胰腺癌細(xì)胞系PANC-1中的β-catenin進(jìn)行檢測，并利用非甾體抗炎藥舒林酸對其干預(yù)，探討其對PANC-1的Wnt/β-catenin信號途徑及增殖、凋亡的影響，探討非甾體抗炎藥在胰腺癌的預(yù)防及治療中的可能價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 舒林酸（sulindac）購于美國Enzo公司（product No：430105G001）；人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物委員會細(xì)胞庫（上海）；兔抗人β-catenin多克隆抗體購買于Santa Cruz公司；生物素化羊抗兔單克隆IgG抗體、免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑盒購于武漢天興生物科技有限公司；MTT試劑盒、Annexin-V/FITC凋亡檢測試劑盒購于江蘇碧云天生物科技有限公司；細(xì)胞裂解液Trizol購于美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購買于美國Fermentas公司；PCR反應(yīng)引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；DMEM高糖培養(yǎng)基購于浙江吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；新生胎牛血清購于美國Hyclone公司；DMSO、EDTA購于美國Sigma公司；2.5%胰蛋白酶購于杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；無水乙醇、碳酸氫鈉購于武漢科瑞生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MTT法檢測舒林酸對PANC-1的生長增殖情況影響：用DMEM高糖培養(yǎng)液（含10%新生胎牛血清）將生長狀況良好的PANC-1細(xì)胞配成單細(xì)胞懸液，以每孔約103個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積100μL，分為6組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。最外一圈加入約150μL無菌PBS防止培養(yǎng)基蒸發(fā)。共4塊培養(yǎng)板，分別編號為A、B、C、D。細(xì)胞在5%CO2，37℃環(huán)境下培養(yǎng)至細(xì)胞單層鋪滿孔底，加入無血清培養(yǎng)基，分別加入含0.25、0.5、1、1.5、2 mM的舒林酸進(jìn)行共培養(yǎng)。分別孵育0、24、48、72 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h每孔加入0.5%MTT溶液20μL，繼續(xù)共培養(yǎng)4 h，倒置顯微鏡下觀察到紫色結(jié)晶后，用巴氏吸管小心吸去上清液，每孔加入150μL DMSO，置搖床上低速震蕩15min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)吸附儀OD490 nm處檢測各孔吸光度值（OD值）。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，以作用時(shí)間為橫坐標(biāo)，PANC-1細(xì)胞抑制率為縱坐標(biāo)繪制曲線，按公式：抑制率=1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值×100%計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.2.2 Annexin-V/FITC雙染法檢測舒林酸對人胰腺癌細(xì)胞PANC-1的細(xì)胞凋亡影響：①取生長狀況良好，經(jīng)臺盼藍(lán)染色，成活細(xì)胞在98%以上的對數(shù)生長期人胰腺癌PANC-1細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。懸浮對數(shù)生長期的人胰腺癌PANC-1細(xì)胞用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1.0×105個(gè)/mL。接種于6孔板中，培養(yǎng)6 h待其貼壁后分為3組：陰性對照組（加入不含舒林酸的培養(yǎng)液）、空白對照組（不不加Annexin V-FITC及PI）和實(shí)驗(yàn)組（分別加入舒林酸濃度為0.25、0.5、1、1.5、2 mM的培養(yǎng)基），繼續(xù)培養(yǎng)48 h。②參照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作。把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至合適的離心管內(nèi)，PBS沖洗PANC-1細(xì)胞一次，加入適量胰蛋白酶液消化，加入上述細(xì)胞培養(yǎng)液，混勻并用巴氏吸管吹打成為單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，1 000 r/min離心5min，棄上清，加入195μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。③加入5μl Annexin V-FITC至懸浮液中，輕輕混勻，避光孵育15min。④向上述懸浮液中加入10μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置，隨即300目濾網(wǎng)過濾，1 h內(nèi)上機(jī)檢測，上述操作均為同步處理。⑤凋亡十字圖左下象限代表正?；罴?xì)胞，右下象限代表早期凋亡細(xì)胞，右上象限代表晚期凋亡和壞死細(xì)胞，左上象限代表實(shí)驗(yàn)許可范圍內(nèi)的檢測誤差。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測舒林酸對人胰腺癌PANC-1細(xì)胞β-catenin蛋白影響：①懸浮生長狀況良好的對數(shù)生長期的人胰腺癌PANC-1細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1.0×105個(gè)/ mL。接種于6孔板中（底部鋪無菌載玻片），培養(yǎng)6 h待其貼壁后分為2組：陰性對照組（加入不含舒林酸的DMSO）和實(shí)驗(yàn)組（分別加入舒林酸濃度為0.25、0.5、1、1.5、2 mM的培養(yǎng)液），繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h；②收獲細(xì)胞，并將爬片用4%多聚甲醛固定15 min后晾干；③水化：將玻片依次置于95%、80%、75%無水乙醇中各5min，然后蒸餾水中漂洗5min；④滅活內(nèi)源性過氧化物酶：將新鮮配置的3%H2O2100μL滴加在玻片上，37℃濕盒孵育15 min，PBS漂洗5min×2次；⑤抗原修復(fù)：置于0.01mM枸櫞酸緩沖液中，微波修復(fù)10 min，室溫自然冷卻后PBS漂洗5 min×3次；⑥封閉非特異性抗原：用10%牛血清蛋白封閉60min后甩去多余液體，不洗；⑦鏡下觀察染色情況，并拍照；⑧在400倍顯微鏡下觀察細(xì)胞爬片，按“米”字形隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，以胞漿和胞核著色判斷陽性，根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)和著色強(qiáng)度進(jìn)行半定量評分：無陽性0分，陽性細(xì)胞1%～30%為1分，31%～70%為2分，71%～100%為3分，然后根據(jù)著色強(qiáng)度依次計(jì)0、1、2、3分，每張爬片2項(xiàng)累計(jì)，0分為陰性（-），1、2分為弱陽性（+），3、4分為陽性（++），5、6分為強(qiáng)陽性（+++）。

2 結(jié)果

2.1 舒林酸對人胰腺癌細(xì)胞PANC-1增殖影響 MTT結(jié)果顯示：分別用0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mM的舒林酸干預(yù)24、48、72 h后，PANC-1細(xì)胞生長均受到不同程度抑制，隨濃度升高，抑制作用越強(qiáng)；實(shí)驗(yàn)組間對比，1.5mM和2.0mM組在48 h、72 h時(shí)抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著藥物干預(yù)時(shí)間延長，48 h后抑制率上升不如48 h前上升明顯（見表1）。

表1 舒林酸作用PANC-1細(xì)胞后A490均值及抑制率（n=3）Tab.1 A490 mean and inhibition rate of sulindac on PANC-1 cells（n=3）

2.2 舒林酸對人胰腺癌細(xì)胞PANC-1的凋亡影響Annexin V-FITC雙染法凋亡檢測顯示，應(yīng)用0、0.5、1.0、1.5、2.0 mM舒林酸處理48 h，PANC-1細(xì)胞早期凋亡率均有不同程度增加，其中0.5、1.0mM組早期凋亡率與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，1.5、2.0mM組與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

表2 不同濃度舒林酸對人胰腺癌細(xì)胞PANC-1細(xì)胞凋亡影響（n=3）Tab.2 Effects of different concentrations of Sulindac on apoptosis of human pancreatic cancer cell line PANC-1 cells（n=3）

圖1 不同濃度舒林酸處理PANC-1細(xì)胞24 h后檢測凋亡十字象限圖Fig.1 Detection of apoptosis in cross quadrant of different concentrations of sulindac treated PANC-1 cells by 24 h

由圖可知，隨著舒林酸濃度的上升，早期凋亡率不斷增加，1.5組及2.0mM組早期凋亡增加較明顯（25.34%、30.31%），與陰性對照組相比（7.15%）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 舒林酸對人胰腺癌細(xì)胞PANC-1內(nèi)β-Catenin的mRNA表達(dá)影響 應(yīng)用不同濃度舒林酸處理人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1，RT-PCR結(jié)果顯示：分別應(yīng)用0、0.5、1.0、1.5、2.0mM的舒林酸處理PANC-1細(xì)胞24 h后，可見各組β-catenin mRNA表達(dá)量隨著舒林酸濃度增加而降低，0.5mM組、1.0mM組與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但1.5mM組及2.0mM組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；應(yīng)用2.0mM的舒林酸處理PANC-1細(xì)胞0、12、24、48、72 h，隨著處理時(shí)間延長，β-Catenin mRNA表達(dá)量逐漸降低，各處理組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見圖2）。

圖2 RT-PCR檢測舒林酸對β-CateninmRNA表達(dá)影響Fig.2 Effect of RT-PCR detection of Sulindac on the expression ofmRNA beta-Catenin

2.4 舒林酸對人胰腺癌細(xì)胞PANC-1內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)及分布影響 免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：在正常胰腺癌細(xì)胞PANC-1中，β-catenin在胞漿和胞核中都有表達(dá)，分別利用0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mM的舒林酸處理PANC-1細(xì)胞24、48 h，染色后對細(xì)胞爬片進(jìn)行ICC評分（見表3），對照組β-catenin陽性及強(qiáng)陽性率為76.1%，1 mM組為56.2%，2 mM組為5.0%，與對照組相比，0.25、0.5 mM組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但1.0、1.5、2.0mM組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 不同濃度舒林酸對人胰腺癌細(xì)胞PANC-1細(xì)胞β-catenin表達(dá)影響（n=3）Tab.3 Effects of different concentrations of Sulindac on human pancreatic carcinoma cell PANC-1 cell catenin（n=3）

隨著舒林酸干預(yù)濃度增加及時(shí)間延長，可見β-Catenin蛋白表達(dá)逐漸降低，伴隨胞核表達(dá)逐漸降低，1.5mM干預(yù)48 h及2.0 mM干預(yù)24、48 h后β-Catenin蛋白胞漿陽性表達(dá)基本消失，且未見核聚集，認(rèn)為舒林酸對β-Catenin蛋白表達(dá)有抑制作用，染色結(jié)果見圖3，其中實(shí)心箭頭表示胞核表達(dá)，空心箭頭表示胞漿表達(dá)。

圖3 不同濃度舒林酸干預(yù)不同時(shí)間β-Catenin蛋白表達(dá)情況（DAB，×400）Fig.3 Different concentrations of sulindac intervention at different time on β-Catenin protein expression（DAB，×400）

3 討論

胰腺癌是惡性程度較高的消化系統(tǒng)腫瘤之一［6-7］，其病因多樣，病情較復(fù)雜，治療較困難，是高致死率腫瘤之一。雖近年手術(shù)切除率較以前有所提高，圍手術(shù)期死亡率及合并癥發(fā)生率較以前有明顯下降，但治療效果仍無顯著改善，五年生存率仍低于5%。近年來胰腺癌的基礎(chǔ)與臨床研究逐漸增加，尤其是在干細(xì)胞學(xué)說、星狀細(xì)胞與胰腺癌的關(guān)系、小干擾RNA及胰腺癌動物模型方面對胰腺癌的發(fā)病原因、腫瘤發(fā)生機(jī)制及侵襲、轉(zhuǎn)移機(jī)制等方面取得了一定進(jìn)展，而Wnt信號通路與胰腺癌的關(guān)系近年也被逐漸認(rèn)識。最近Mook RA等［8］報(bào)道結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移通常與Wnt/β-Catenin的異常激活和S100A4表達(dá)相關(guān)，S100A4是β-catenin的下游轉(zhuǎn)錄激活基因之一，他們利用舒林酸處理不同結(jié)腸癌細(xì)胞系，能降低β-catenin的濃度及核聚集，同時(shí)在動物試驗(yàn)中證實(shí)舒林酸能降低腫瘤的轉(zhuǎn)移，與β-catenin降低及S100A4減少有關(guān)。他們認(rèn)為舒林酸能調(diào)節(jié)β-catenin信號具有抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的潛質(zhì)。

本研究分別用不同濃度舒林酸干預(yù)PANC-1細(xì)胞24、48、72 h，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長均受到不同程度抑制，且隨著濃度升高，抑制作用越強(qiáng)。凋亡實(shí)驗(yàn)顯示：應(yīng)用不同濃度的舒林酸處理PANC-1細(xì)胞24 h，細(xì)胞早期凋亡率均有不同程度增加，0.5、1.0mM組早期凋亡率與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而1.5及2.0mM組與陰性對照相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明藥物濃度均在1.5及2.0mM具有較明顯的生長抑制及凋亡誘導(dǎo)作用。利用RT-PCR及免疫細(xì)胞化研究舒林酸對β-catenin表達(dá)影響發(fā)現(xiàn)，β-cateninmRNA及蛋白表達(dá)均受抑制，隨著時(shí)間延長，βcateninmRNA表達(dá)量逐漸降低，在1.5及2.0mM組差異較明顯，免疫細(xì)胞化發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度計(jì)作用時(shí)間延長，β-Catenin蛋白陽性表達(dá)逐漸降低，伴隨胞核表達(dá)逐漸降低，1.5 mM干預(yù)48 h及2.0mM干預(yù)24、48 h后β-Catenin蛋白胞漿陽性表達(dá)基本消失，且未見核聚集，認(rèn)為舒林酸對β-Catenin蛋白表達(dá)有抑制作用。

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（編校：吳茜）

Effect of sulindac on human pancreatic cancer cell PANC-1 proliferation and apoptosis and its possiblemechanism

BIAN Bao-xiang1，SONG Zi-yan1，XIONG Guang-su2

（1.Department of Medicine-Oncology，Lianyungang Hospital Affiliated to Xuzhou Medical College，Lianyungang 222002，China；2.Department of Clinical Internal Medicine，Shanghai JiaoTong University，Shanghai200240，China）

ObjectiveTo discuss the influence of different concentration sulindac on pancreatic cancer cell line PANC-1 cell proliferation and apoptosis，and investigate the possible mechanism that sulindac can inhibit the Wnt/beta-catenin pathway to kill pancreatic cancer cells.MethodsPANC-1 cellwere divided into negative control group（added containing no sulindac DMSO）and experimental group（added sulindac with concentrations of 0.25，0.5，1，1.5，2mM medium，respectively，name as 0.25mM group，0.5mM group，1.0mM group，1.5mM group，2.0mM group），and treated with different time，cell proliferation inhibition ratio in each group was detected by MTT assay，cell apoptosis ratiowas detected by flow cytometry，the expression ofβ-catenin mRNA and protein were detected by RT-PCR and immunocytochemistry.ResultsMTT results showed that sulindac can inhibit the cell proliferation of PANC-1 by a dose-and time-dependentmanner.Cell apoptosis increased after sulindac treatment in different degrees，and therewere statistical differences between 1.5，2.0mM group and controlgroups（P＜0.05）.RT-PCR results showed that the expression of β-catenin mRNA decreased after the treatmentof sulindac，therewere statistical differences between 1.5，2.0mM group and control group（P＜0.05）. In the 2.0mM group，the expression ofβ-catenin decreased along with the time extending（P＜0.05）.ICC results showed that sulindac inhibited the expression ofβ-catenin protein and nuclear accumulation，there were no statistical differences in 0.25，0.5mM group and control group，but there were statistical differences in 1.0，1.5，2.0mM group.ConclusionSulindac could inhibit cell proliferation and facilitate apoptosis of PANC-1，this effect is dose-and time-dependent.The inhibition ofWnt/beta-catenin signal pathway may be a possiblemechanism of its cytotoxicity.

sulindac；human pancreatic cancer line PANC-1；Wnt/β-catenin signal pathway；proliferation and apoptosis

卞保祥，男，研究生，副主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤內(nèi)科綜合治療，E-mail：qch1821460098@163.com。

R735.9

A

1005-1678(2014）07-0023-04

2009年教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目（20090073120092）