東莞市不育與生育正常青年男性精子功能的對照分析

劉志剛++++++陳麗梅++++++伍玉燕++++++鐘樹懷++++++劉淑慎

[摘要] 目的 對比分析東莞市不育青年男性與生育正常青年男性各項精子功能指標。 方法 回顧性分析本院120例年齡在25~34歲的青年男性患者，依據(jù)生育功能差異將其分為不育組（60例），規(guī)律性生活未避孕1年而不孕；對照組（60例），1年內(nèi)令配偶正常受孕。比較兩組的精子密度，精子活力參數(shù)[包括平均曲線運動速度（VCL）、平均路徑運動速度（VAP）及精子平均鞭打頻率（BCF）]，精子運動方式參數(shù)[包括運動直線性（LN）、運動擺動性（WOB）、運動前向性（STR）及運動側(cè)擺幅度（ALH）]，精子形態(tài)指標，精子DNA碎片指數(shù)（DFI），頂體酶活性和生育力指數(shù)（FI）的差異。 結(jié)果 不育組的精子密度、精子活力參數(shù)（VCL、VAP及BCF）、精子運動方式參數(shù)（LN、WOB、STR及ALH）與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；不育組的正常形態(tài)精子百分率、DFI、頂體酶活性及FI顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 東莞市不育青年男性的各項精子功能指標顯著較生育正常青年男性差。

[關(guān)鍵詞] 不育男（雄）性；精子功能；頂體蛋白酶

[中圖分類號] R698+.2[文獻標識碼] B[文章編號] 1674-4721（2014）06（c）-0148-03

Comparison of sperm functions to infertility and normal fertility of youth male in Dongguan city

LIU Zhi-gang CHEN Li-mei WU Yu-yan ZHONG Shu-huai LIU Shu-shen

Department of Reproductive Medicine,Dongguan People′s Hospital of Guangdong Province,Dongguan 523000,China

[Abstract] Objective To compare the sperm functions to infertility and normal fertility of youth male in Dongguan city. Methods A total of 120 youth male whose age range was from 25 years to 34 years were collected to retrospectively analyze,and were divided into infertility group (60 cases,regular sexual life without contraception one year) and control group (60 cases,spouse pregnancy in one year) according to the reproductive function variation.The indexes of sperm concentration,sperm motility parameters [including the mean velocity of curvilinear (VCL),the velocity of average path (VAP),beat cross frequency (BCF)],sperm motion parameters [including the linear movement (LN),wobble movement (WOB),mean straightness (STR) and amplitude of lateral head displacement (ALH)],sperm morphology index,sperm DNA fragmentation index (DFI),acrosomal enzyme activities and fertility index (FI) were compared between two groups. Results Compared with control group,the indexes of sperm concentration,sperm motility parameters (VCL,VAP and BCF),sperm motion parameters (LN,WOB,STR and ALH) in research group had no significant different (P>0.05),but the percent of normal morphology sperm,DFI,acrosomal enzyme activities and FI in research group was lower,the difference was significant (P<0.05). Conclusion The indexes of sperm functions to infertility youth male in Dongguan city are poorer than that to normal fertility of youth male.

[Key words] Infertility youth male;Sperm function;Acrosomal enzyme

男性不育癥是指因男方因素所致的正常未避孕性生活1年以上仍不能使配偶懷孕，男性不育癥在全世界都存在，已成為國際范圍內(nèi)的醫(yī)學(xué)研究熱點[1]。雖然男性不育癥并非是致命性疾病，但會影響個人幸福、家庭和睦，造成嚴重的社會問題[2]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，男性不育癥占不孕不育癥的8%～30%，而隨著經(jīng)濟發(fā)展、環(huán)境污染等因素，其發(fā)病率會逐年增加[3]。東莞市育齡期人口眾多，且不孕不育癥夫婦基數(shù)也龐大，男性不育癥已日益成為東莞市生殖醫(yī)學(xué)常見的疾病。目前，對男性不育癥的診斷和治療，主要依賴于精液實驗室檢測指標。然而目前對于東莞市不育男性精子的受精能力進行分析的臨床研究尚未見報道，因此本研究通過比較東莞市不育男性與正常男性精子功能評估該地區(qū)不育男性生育力，為進一步加強本市的助孕技術(shù)提供流行病學(xué)資料。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年1月～2013年12月在本院就診的120例不育青年男性患者作為研究對象，年齡25~34歲，平均（30.5±4.6）歲。入選標準：①依據(jù)WHO診斷標準，即規(guī)律性生活未避孕1年不孕，并排除女方因素（包括輸卵管因素、排卵問題、宮頸因素等）；②年齡<35歲；③自愿參加本研究，并簽訂知情同意書。排除標準：①有睪丸病變、染色體異常、激素紊亂等原因?qū)е碌牟挥?；②由于細菌、支原體以及衣原體等病原微生物感染影響精子質(zhì)量；③器質(zhì)性和功能性不育患者；④1個月內(nèi)未服用影響精子功能的藥物。依據(jù)生育功能的差異將120例患者分為不育組（60例），規(guī)律性生活未避孕1年仍未能使配偶懷孕；對照組（60例），1年內(nèi)令配偶正常受孕。兩組研究對象的年齡、體質(zhì)量指數(shù)、原發(fā)疾病及癥狀、體征差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表1），具有可比性。

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表1 兩組研究對象一般資料的比較

1.2 樣本收取

按照WHO規(guī)定方法，禁止性生活3～7 d，在生殖中心取精室以手淫方式規(guī)范收取精子樣本，待所有精液標本在37℃環(huán)境溫度下20～30 min完全液化后，進行精子功能實驗室檢測。

1.3 精子密度和活動力檢測

應(yīng)用計算機輔助精子分析系統(tǒng)（CASA）檢測精子相關(guān)參數(shù)，主要包括：精子密度，精子活力參數(shù)[包括平均曲線運動速度（VCL）、平均路徑運動速度（VAP）及精子平均鞭打頻率（BCF）]，精子運動方式參數(shù)[包括運動直線性（LN）、運動擺動性（WOB）、運動前向性（STR）及運動側(cè)擺幅度（ALH）]。

1.4 精子形態(tài)指標檢測

采用DiffQuik染色法檢測精子形態(tài)，具體操作為，根據(jù)不同性狀的精液標本選擇不同的精液涂片，以保證精液在涂片表面分布均勻，在400倍光鏡下每視野至少有40個精子，且精子無成團及重疊等現(xiàn)象。將涂片在溶液1與溶液2中分別浸泡10 s及5 s，應(yīng)用油鏡觀察視野中的精子形態(tài)，計算正常形態(tài)精子百分率。

1.5 精子DNA碎片指數(shù)（DFI）、頂體酶活性及生育力指數(shù)（FI）檢測

采用精子染色質(zhì)擴散試驗（SCD）檢測精液涂片標本，使用DAPI進行熒光染色后應(yīng)用熒光顯微鏡觀察，計算精子DNA碎片比例。

應(yīng)用Kennedy法檢測患者頂體酶活性，頂體酶活性計算公式為（測定管OD值-對照組OD值）×106×247.5×7.5。

通過去透明帶倉鼠人精子穿透試驗（SPA）檢測FI，計算公式為穿入卵子的精子總數(shù)與卵子總數(shù)的商。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以x±s表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組精子密度和活動力的比較

不育組的精子密度、精子活力參數(shù)（VCL、VAP及BCF）、精子運動方式參數(shù)（LN、WOB、STR及ALH）與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

表2 兩組精子密度和活動力的比較（x±s）

2.2 兩組精子形態(tài)、DFI、頂體酶活性及FI的比較

不育組的正常形態(tài)精子百分率、DFI、頂體酶活性以及FI顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表3）。

表3 兩組精子形態(tài)、DFI、頂體酶活性及FI的比較（x±s）

3 討論

根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，國內(nèi)的男性不育癥發(fā)病率呈逐年增加的趨勢，已是生殖醫(yī)學(xué)臨床常見的疾病之一[5-6]。由于不孕不育癥不僅是臨床醫(yī)學(xué)范疇，而且已成為社會性問題，與家庭的幸福和睦有密切相關(guān)性[7]。近年來包括男性不育癥在內(nèi)的不孕不育癥病例在快速上升，特別在經(jīng)濟發(fā)展較快的地區(qū)[7]，如東莞市男性不育癥發(fā)病率較國內(nèi)平均水平高，研究結(jié)果顯示其與環(huán)境污染有較高的相關(guān)性。因此深入研究分析東莞市男性不育癥的發(fā)病現(xiàn)狀以及相關(guān)因素是臨床治療的關(guān)鍵，也為進一步加強東莞市的助孕技術(shù)提供流行病學(xué)資料[8]。既往不孕不育癥的相關(guān)研究重點在女方因素導(dǎo)致的不孕，也已取得較多研究成果，對于指導(dǎo)臨床治療也獲得了較好的臨床效益，但是男方因素導(dǎo)致的不育癥的相關(guān)研究比較少，也制約了對男性不育癥更好的臨床治療，因此加強男性不育癥病因檢查研究的臨床意義重大[9]。

目前，對男性不育癥的診斷和病因篩查仍然是精液實驗室常規(guī)分析指標，主要包括：精子濃度、精子運動活力、側(cè)向運動振幅以及精子形態(tài)學(xué)檢測[10]。然而傳統(tǒng)的精液常規(guī)分析不能準確地反映患者精子的受精能力，因此臨床需要多個檢測精子功能的方法，綜合判斷男性受檢者的生育力[11]。近年來電腦輔助系統(tǒng)的精子分析儀受到臨床重視，能對精子形態(tài)以及動力學(xué)特征進行綜合分析。由于受精能力是妊娠發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，其中頂體酶活性是精子通過頂體反應(yīng)穿透卵子的關(guān)鍵步驟，因此為了解精子受精功能狀態(tài)，需要對頂體酶活性進行定量分析[12]。精子DNA碎片檢測能敏感檢測出精子發(fā)生過程中出現(xiàn)的異常原因，如：異常染色體包裝、細胞凋亡等。精子DNA碎片化程度越高，受精能力就越低，同時助孕成功率以及反復(fù)流產(chǎn)率就越高[13]。本研究還通過去透明帶倉鼠人SPA檢測男性不育癥的FI，這能反映出獲能與頂體反應(yīng)兩個過程，因此也被認為是評價精子受精能力的一種可靠技術(shù)。國內(nèi)外對這些新技術(shù)尚未廣泛用于臨床，且將不育男性與正常男性的精子功能進行臨床對照研究尚未有見報道，嚴重影響受精功能的評估，使男性不育癥真正病因的篩查遇到困難。因此本研究認為，盡快建立東莞市男性不育患者受精功能檢查指標的正常值，了解與正常男性的各項受精功能的差異是極為重要的，故本研究通過將男性不育患者與正常男性的精子功能進行對比分析，有利于評估東莞市的男性不育癥現(xiàn)狀以及為加強本市的助孕技術(shù)提供流行病學(xué)資料。

本研究結(jié)果顯示，與對照相比，不育組男性患者的精液功能實驗室常規(guī)分析指標，如：精子濃度、精子運動活力、側(cè)向運動振幅以及精子正常形態(tài)學(xué)檢測百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明東莞市的不育癥男性精子功能降低，難以應(yīng)用精液實驗室常規(guī)分析來鑒別，因此精液實驗室常規(guī)不宜作為男性不育癥的篩檢方法。進一步研究分析顯示，不育組男性患者的DFI、頂體酶活性及FI指數(shù)均顯著較低，證實東莞市的不育癥男性存在精子受精功能低下，生育能力差，因此也能做為男性不育癥的較好檢測方法。但是本研究中考慮到樣本量過小，因而DFI、頂體酶活性及FI指數(shù)檢測對于男性不育癥的精子功能評估價值仍需要大規(guī)模、多中心的臨床研究來證實。

[參考文獻]

[1]Anawalt BD.Approach to male infertility and induction of spermatogenesis[J].J Clin Endocrinol Metab，2013，98（9）：3532-3542.

[2]De Fleurian G，Perrin J，Ecochard R，et al.Occupational exposures obtained by questionnaire in clinical practice and their association with semen quality[J].J Androl，2009，30（5）：566-579.

[3]陳可，包華瓊，丁杰，等.精子頂體酶活性與精液常規(guī)檢查參數(shù)關(guān)系分析[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2011，8（14）：8-10.

[4]McKnight K，Hoang HD，Prasain JK，et al.Neurosensory perception of environmental cues modulates sperm motility critical for fertilization[J].Science，2014，344（6185）：754-757.

[5]丁金龍，屠鳳娟.紹興地區(qū)361例男性不育癥患者精液常規(guī)檢驗分析[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2006，14（3）：106-106.

[6]Palermo GD，Kocent J，Monahan D，et al.Treatment of male infertility[J].Methods Mol Biol，2014，1154：385-405.

[7]張運麗，吳清陽，史順楊，等.長沙地區(qū)2794例男性不育患者精液常規(guī)結(jié)果分析[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2012，22（12）：51-53.

[8]鄭九嘉，楊旭，張李雅，等.精子DNA損傷、核蛋白組型轉(zhuǎn)換與頂體酶活性及精液參數(shù)的相關(guān)性分析[J].中華男科學(xué)雜志，2012，18（10）：925-929.

[9]Hwang DS，Jeon TG，Park HJ，et al.The attitudes of infertile male patients toward the use of artificial insemination by donor： a korean regional survey[J].Korean J Urol，2014， 55（2）：134-139.

[10]劉錦宏，李小珍.男性不育癥患者精液質(zhì)量與精子頂體酶活性關(guān)系分析[J].長治醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，27（2）：125-127.

[11]Simon L，Castillo J，Oliva R，et al.Relationships between human sperm protamines，DNA damage and assisted reproduction outcomes[J].Reprod Biomed Online，2011，23（6）：724-734.

[12]Robinson L，Gallos ID，Conner SJ，et al.The effect of sperm DNA fragmentation on miscarriage rates： a systematic review and meta-analysis[J].Hum Reprod，2012，27（10）：2908-2917.

[13]Fanaei H，Khayat S，Halvaei I，et al.Effects of ascorbic acid on sperm motility，viability，acrosome reaction and DNA integrity in teratozoospermic samples[J].Iran J Reprod Med，2014，12（2）：103-110.

（收稿日期：2014-03-15本文編輯：郭靜娟）

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表1 兩組研究對象一般資料的比較

1.2 樣本收取

按照WHO規(guī)定方法，禁止性生活3～7 d，在生殖中心取精室以手淫方式規(guī)范收取精子樣本，待所有精液標本在37℃環(huán)境溫度下20～30 min完全液化后，進行精子功能實驗室檢測。

1.3 精子密度和活動力檢測

應(yīng)用計算機輔助精子分析系統(tǒng)（CASA）檢測精子相關(guān)參數(shù)，主要包括：精子密度，精子活力參數(shù)[包括平均曲線運動速度（VCL）、平均路徑運動速度（VAP）及精子平均鞭打頻率（BCF）]，精子運動方式參數(shù)[包括運動直線性（LN）、運動擺動性（WOB）、運動前向性（STR）及運動側(cè)擺幅度（ALH）]。

1.4 精子形態(tài)指標檢測

采用DiffQuik染色法檢測精子形態(tài)，具體操作為，根據(jù)不同性狀的精液標本選擇不同的精液涂片，以保證精液在涂片表面分布均勻，在400倍光鏡下每視野至少有40個精子，且精子無成團及重疊等現(xiàn)象。將涂片在溶液1與溶液2中分別浸泡10 s及5 s，應(yīng)用油鏡觀察視野中的精子形態(tài)，計算正常形態(tài)精子百分率。

1.5 精子DNA碎片指數(shù)（DFI）、頂體酶活性及生育力指數(shù)（FI）檢測

采用精子染色質(zhì)擴散試驗（SCD）檢測精液涂片標本，使用DAPI進行熒光染色后應(yīng)用熒光顯微鏡觀察，計算精子DNA碎片比例。

應(yīng)用Kennedy法檢測患者頂體酶活性，頂體酶活性計算公式為（測定管OD值-對照組OD值）×106×247.5×7.5。

通過去透明帶倉鼠人精子穿透試驗（SPA）檢測FI，計算公式為穿入卵子的精子總數(shù)與卵子總數(shù)的商。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以x±s表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組精子密度和活動力的比較

不育組的精子密度、精子活力參數(shù)（VCL、VAP及BCF）、精子運動方式參數(shù)（LN、WOB、STR及ALH）與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

表2 兩組精子密度和活動力的比較（x±s）

2.2 兩組精子形態(tài)、DFI、頂體酶活性及FI的比較

不育組的正常形態(tài)精子百分率、DFI、頂體酶活性以及FI顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表3）。

表3 兩組精子形態(tài)、DFI、頂體酶活性及FI的比較（x±s）

3 討論

根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，國內(nèi)的男性不育癥發(fā)病率呈逐年增加的趨勢，已是生殖醫(yī)學(xué)臨床常見的疾病之一[5-6]。由于不孕不育癥不僅是臨床醫(yī)學(xué)范疇，而且已成為社會性問題，與家庭的幸福和睦有密切相關(guān)性[7]。近年來包括男性不育癥在內(nèi)的不孕不育癥病例在快速上升，特別在經(jīng)濟發(fā)展較快的地區(qū)[7]，如東莞市男性不育癥發(fā)病率較國內(nèi)平均水平高，研究結(jié)果顯示其與環(huán)境污染有較高的相關(guān)性。因此深入研究分析東莞市男性不育癥的發(fā)病現(xiàn)狀以及相關(guān)因素是臨床治療的關(guān)鍵，也為進一步加強東莞市的助孕技術(shù)提供流行病學(xué)資料[8]。既往不孕不育癥的相關(guān)研究重點在女方因素導(dǎo)致的不孕，也已取得較多研究成果，對于指導(dǎo)臨床治療也獲得了較好的臨床效益，但是男方因素導(dǎo)致的不育癥的相關(guān)研究比較少，也制約了對男性不育癥更好的臨床治療，因此加強男性不育癥病因檢查研究的臨床意義重大[9]。

目前，對男性不育癥的診斷和病因篩查仍然是精液實驗室常規(guī)分析指標，主要包括：精子濃度、精子運動活力、側(cè)向運動振幅以及精子形態(tài)學(xué)檢測[10]。然而傳統(tǒng)的精液常規(guī)分析不能準確地反映患者精子的受精能力，因此臨床需要多個檢測精子功能的方法，綜合判斷男性受檢者的生育力[11]。近年來電腦輔助系統(tǒng)的精子分析儀受到臨床重視，能對精子形態(tài)以及動力學(xué)特征進行綜合分析。由于受精能力是妊娠發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，其中頂體酶活性是精子通過頂體反應(yīng)穿透卵子的關(guān)鍵步驟，因此為了解精子受精功能狀態(tài)，需要對頂體酶活性進行定量分析[12]。精子DNA碎片檢測能敏感檢測出精子發(fā)生過程中出現(xiàn)的異常原因，如：異常染色體包裝、細胞凋亡等。精子DNA碎片化程度越高，受精能力就越低，同時助孕成功率以及反復(fù)流產(chǎn)率就越高[13]。本研究還通過去透明帶倉鼠人SPA檢測男性不育癥的FI，這能反映出獲能與頂體反應(yīng)兩個過程，因此也被認為是評價精子受精能力的一種可靠技術(shù)。國內(nèi)外對這些新技術(shù)尚未廣泛用于臨床，且將不育男性與正常男性的精子功能進行臨床對照研究尚未有見報道，嚴重影響受精功能的評估，使男性不育癥真正病因的篩查遇到困難。因此本研究認為，盡快建立東莞市男性不育患者受精功能檢查指標的正常值，了解與正常男性的各項受精功能的差異是極為重要的，故本研究通過將男性不育患者與正常男性的精子功能進行對比分析，有利于評估東莞市的男性不育癥現(xiàn)狀以及為加強本市的助孕技術(shù)提供流行病學(xué)資料。

本研究結(jié)果顯示，與對照相比，不育組男性患者的精液功能實驗室常規(guī)分析指標，如：精子濃度、精子運動活力、側(cè)向運動振幅以及精子正常形態(tài)學(xué)檢測百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明東莞市的不育癥男性精子功能降低，難以應(yīng)用精液實驗室常規(guī)分析來鑒別，因此精液實驗室常規(guī)不宜作為男性不育癥的篩檢方法。進一步研究分析顯示，不育組男性患者的DFI、頂體酶活性及FI指數(shù)均顯著較低，證實東莞市的不育癥男性存在精子受精功能低下，生育能力差，因此也能做為男性不育癥的較好檢測方法。但是本研究中考慮到樣本量過小，因而DFI、頂體酶活性及FI指數(shù)檢測對于男性不育癥的精子功能評估價值仍需要大規(guī)模、多中心的臨床研究來證實。

[參考文獻]

[1]Anawalt BD.Approach to male infertility and induction of spermatogenesis[J].J Clin Endocrinol Metab，2013，98（9）：3532-3542.

[2]De Fleurian G，Perrin J，Ecochard R，et al.Occupational exposures obtained by questionnaire in clinical practice and their association with semen quality[J].J Androl，2009，30（5）：566-579.

[3]陳可，包華瓊，丁杰，等.精子頂體酶活性與精液常規(guī)檢查參數(shù)關(guān)系分析[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2011，8（14）：8-10.

[4]McKnight K，Hoang HD，Prasain JK，et al.Neurosensory perception of environmental cues modulates sperm motility critical for fertilization[J].Science，2014，344（6185）：754-757.

[5]丁金龍，屠鳳娟.紹興地區(qū)361例男性不育癥患者精液常規(guī)檢驗分析[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2006，14（3）：106-106.

[6]Palermo GD，Kocent J，Monahan D，et al.Treatment of male infertility[J].Methods Mol Biol，2014，1154：385-405.

[7]張運麗，吳清陽，史順楊，等.長沙地區(qū)2794例男性不育患者精液常規(guī)結(jié)果分析[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2012，22（12）：51-53.

[8]鄭九嘉，楊旭，張李雅，等.精子DNA損傷、核蛋白組型轉(zhuǎn)換與頂體酶活性及精液參數(shù)的相關(guān)性分析[J].中華男科學(xué)雜志，2012，18（10）：925-929.

[9]Hwang DS，Jeon TG，Park HJ，et al.The attitudes of infertile male patients toward the use of artificial insemination by donor： a korean regional survey[J].Korean J Urol，2014， 55（2）：134-139.

[10]劉錦宏，李小珍.男性不育癥患者精液質(zhì)量與精子頂體酶活性關(guān)系分析[J].長治醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，27（2）：125-127.

[11]Simon L，Castillo J，Oliva R，et al.Relationships between human sperm protamines，DNA damage and assisted reproduction outcomes[J].Reprod Biomed Online，2011，23（6）：724-734.

[12]Robinson L，Gallos ID，Conner SJ，et al.The effect of sperm DNA fragmentation on miscarriage rates： a systematic review and meta-analysis[J].Hum Reprod，2012，27（10）：2908-2917.

[13]Fanaei H，Khayat S，Halvaei I，et al.Effects of ascorbic acid on sperm motility，viability，acrosome reaction and DNA integrity in teratozoospermic samples[J].Iran J Reprod Med，2014，12（2）：103-110.

（收稿日期：2014-03-15本文編輯：郭靜娟）

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表1 兩組研究對象一般資料的比較

1.2 樣本收取

按照WHO規(guī)定方法，禁止性生活3～7 d，在生殖中心取精室以手淫方式規(guī)范收取精子樣本，待所有精液標本在37℃環(huán)境溫度下20～30 min完全液化后，進行精子功能實驗室檢測。

1.3 精子密度和活動力檢測

應(yīng)用計算機輔助精子分析系統(tǒng)（CASA）檢測精子相關(guān)參數(shù)，主要包括：精子密度，精子活力參數(shù)[包括平均曲線運動速度（VCL）、平均路徑運動速度（VAP）及精子平均鞭打頻率（BCF）]，精子運動方式參數(shù)[包括運動直線性（LN）、運動擺動性（WOB）、運動前向性（STR）及運動側(cè)擺幅度（ALH）]。

1.4 精子形態(tài)指標檢測

采用DiffQuik染色法檢測精子形態(tài)，具體操作為，根據(jù)不同性狀的精液標本選擇不同的精液涂片，以保證精液在涂片表面分布均勻，在400倍光鏡下每視野至少有40個精子，且精子無成團及重疊等現(xiàn)象。將涂片在溶液1與溶液2中分別浸泡10 s及5 s，應(yīng)用油鏡觀察視野中的精子形態(tài)，計算正常形態(tài)精子百分率。

1.5 精子DNA碎片指數(shù)（DFI）、頂體酶活性及生育力指數(shù)（FI）檢測

采用精子染色質(zhì)擴散試驗（SCD）檢測精液涂片標本，使用DAPI進行熒光染色后應(yīng)用熒光顯微鏡觀察，計算精子DNA碎片比例。

應(yīng)用Kennedy法檢測患者頂體酶活性，頂體酶活性計算公式為（測定管OD值-對照組OD值）×106×247.5×7.5。

通過去透明帶倉鼠人精子穿透試驗（SPA）檢測FI，計算公式為穿入卵子的精子總數(shù)與卵子總數(shù)的商。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以x±s表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組精子密度和活動力的比較

不育組的精子密度、精子活力參數(shù)（VCL、VAP及BCF）、精子運動方式參數(shù)（LN、WOB、STR及ALH）與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

表2 兩組精子密度和活動力的比較（x±s）

2.2 兩組精子形態(tài)、DFI、頂體酶活性及FI的比較

不育組的正常形態(tài)精子百分率、DFI、頂體酶活性以及FI顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表3）。

表3 兩組精子形態(tài)、DFI、頂體酶活性及FI的比較（x±s）

3 討論

根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，國內(nèi)的男性不育癥發(fā)病率呈逐年增加的趨勢，已是生殖醫(yī)學(xué)臨床常見的疾病之一[5-6]。由于不孕不育癥不僅是臨床醫(yī)學(xué)范疇，而且已成為社會性問題，與家庭的幸福和睦有密切相關(guān)性[7]。近年來包括男性不育癥在內(nèi)的不孕不育癥病例在快速上升，特別在經(jīng)濟發(fā)展較快的地區(qū)[7]，如東莞市男性不育癥發(fā)病率較國內(nèi)平均水平高，研究結(jié)果顯示其與環(huán)境污染有較高的相關(guān)性。因此深入研究分析東莞市男性不育癥的發(fā)病現(xiàn)狀以及相關(guān)因素是臨床治療的關(guān)鍵，也為進一步加強東莞市的助孕技術(shù)提供流行病學(xué)資料[8]。既往不孕不育癥的相關(guān)研究重點在女方因素導(dǎo)致的不孕，也已取得較多研究成果，對于指導(dǎo)臨床治療也獲得了較好的臨床效益，但是男方因素導(dǎo)致的不育癥的相關(guān)研究比較少，也制約了對男性不育癥更好的臨床治療，因此加強男性不育癥病因檢查研究的臨床意義重大[9]。

目前，對男性不育癥的診斷和病因篩查仍然是精液實驗室常規(guī)分析指標，主要包括：精子濃度、精子運動活力、側(cè)向運動振幅以及精子形態(tài)學(xué)檢測[10]。然而傳統(tǒng)的精液常規(guī)分析不能準確地反映患者精子的受精能力，因此臨床需要多個檢測精子功能的方法，綜合判斷男性受檢者的生育力[11]。近年來電腦輔助系統(tǒng)的精子分析儀受到臨床重視，能對精子形態(tài)以及動力學(xué)特征進行綜合分析。由于受精能力是妊娠發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，其中頂體酶活性是精子通過頂體反應(yīng)穿透卵子的關(guān)鍵步驟，因此為了解精子受精功能狀態(tài)，需要對頂體酶活性進行定量分析[12]。精子DNA碎片檢測能敏感檢測出精子發(fā)生過程中出現(xiàn)的異常原因，如：異常染色體包裝、細胞凋亡等。精子DNA碎片化程度越高，受精能力就越低，同時助孕成功率以及反復(fù)流產(chǎn)率就越高[13]。本研究還通過去透明帶倉鼠人SPA檢測男性不育癥的FI，這能反映出獲能與頂體反應(yīng)兩個過程，因此也被認為是評價精子受精能力的一種可靠技術(shù)。國內(nèi)外對這些新技術(shù)尚未廣泛用于臨床，且將不育男性與正常男性的精子功能進行臨床對照研究尚未有見報道，嚴重影響受精功能的評估，使男性不育癥真正病因的篩查遇到困難。因此本研究認為，盡快建立東莞市男性不育患者受精功能檢查指標的正常值，了解與正常男性的各項受精功能的差異是極為重要的，故本研究通過將男性不育患者與正常男性的精子功能進行對比分析，有利于評估東莞市的男性不育癥現(xiàn)狀以及為加強本市的助孕技術(shù)提供流行病學(xué)資料。

本研究結(jié)果顯示，與對照相比，不育組男性患者的精液功能實驗室常規(guī)分析指標，如：精子濃度、精子運動活力、側(cè)向運動振幅以及精子正常形態(tài)學(xué)檢測百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明東莞市的不育癥男性精子功能降低，難以應(yīng)用精液實驗室常規(guī)分析來鑒別，因此精液實驗室常規(guī)不宜作為男性不育癥的篩檢方法。進一步研究分析顯示，不育組男性患者的DFI、頂體酶活性及FI指數(shù)均顯著較低，證實東莞市的不育癥男性存在精子受精功能低下，生育能力差，因此也能做為男性不育癥的較好檢測方法。但是本研究中考慮到樣本量過小，因而DFI、頂體酶活性及FI指數(shù)檢測對于男性不育癥的精子功能評估價值仍需要大規(guī)模、多中心的臨床研究來證實。

[參考文獻]

[1]Anawalt BD.Approach to male infertility and induction of spermatogenesis[J].J Clin Endocrinol Metab，2013，98（9）：3532-3542.

[2]De Fleurian G，Perrin J，Ecochard R，et al.Occupational exposures obtained by questionnaire in clinical practice and their association with semen quality[J].J Androl，2009，30（5）：566-579.

[3]陳可，包華瓊，丁杰，等.精子頂體酶活性與精液常規(guī)檢查參數(shù)關(guān)系分析[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2011，8（14）：8-10.

[4]McKnight K，Hoang HD，Prasain JK，et al.Neurosensory perception of environmental cues modulates sperm motility critical for fertilization[J].Science，2014，344（6185）：754-757.

[5]丁金龍，屠鳳娟.紹興地區(qū)361例男性不育癥患者精液常規(guī)檢驗分析[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2006，14（3）：106-106.

[6]Palermo GD，Kocent J，Monahan D，et al.Treatment of male infertility[J].Methods Mol Biol，2014，1154：385-405.

[7]張運麗，吳清陽，史順楊，等.長沙地區(qū)2794例男性不育患者精液常規(guī)結(jié)果分析[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2012，22（12）：51-53.

[8]鄭九嘉，楊旭，張李雅，等.精子DNA損傷、核蛋白組型轉(zhuǎn)換與頂體酶活性及精液參數(shù)的相關(guān)性分析[J].中華男科學(xué)雜志，2012，18（10）：925-929.

[9]Hwang DS，Jeon TG，Park HJ，et al.The attitudes of infertile male patients toward the use of artificial insemination by donor： a korean regional survey[J].Korean J Urol，2014， 55（2）：134-139.

[10]劉錦宏，李小珍.男性不育癥患者精液質(zhì)量與精子頂體酶活性關(guān)系分析[J].長治醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，27（2）：125-127.

[11]Simon L，Castillo J，Oliva R，et al.Relationships between human sperm protamines，DNA damage and assisted reproduction outcomes[J].Reprod Biomed Online，2011，23（6）：724-734.

[12]Robinson L，Gallos ID，Conner SJ，et al.The effect of sperm DNA fragmentation on miscarriage rates： a systematic review and meta-analysis[J].Hum Reprod，2012，27（10）：2908-2917.

[13]Fanaei H，Khayat S，Halvaei I，et al.Effects of ascorbic acid on sperm motility，viability，acrosome reaction and DNA integrity in teratozoospermic samples[J].Iran J Reprod Med，2014，12（2）：103-110.

（收稿日期：2014-03-15本文編輯：郭靜娟）

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