小鼠過敏性哮喘模型制備的特點(diǎn)分析

馬子風(fēng)，尹磊淼，冉君，王宇，徐玉東，管楠，楊永清

(上海中醫(yī)藥大學(xué) 上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所，上海 200030)

過敏性哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重影響人類健康[1]，已成為全球性社會(huì)衛(wèi)生問題[2]。哮喘發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[3]，疾病動(dòng)物模型作為生命科學(xué)研究的重要支撐條件極大地促進(jìn)了對(duì)哮喘病理生理機(jī)制的理解[4]。作為最常用的免疫研究工具，小鼠哮喘模型可模擬人類哮喘的速發(fā)相及遲發(fā)相反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)性炎癥以及氣道重塑特征，并在哮喘發(fā)病機(jī)制的相關(guān)分子研究中發(fā)揮著重要作用[5]。

目前小鼠哮喘模型已廣泛應(yīng)用在變應(yīng)性哮喘、感染性哮喘、運(yùn)動(dòng)性哮喘、壓力性哮喘、心理應(yīng)激哮喘以及職業(yè)性哮喘等研究方面。根據(jù)不同類型研究的需要，模型制作方法不盡相同。在小鼠哮喘模型的制作過程中，小鼠品系、致敏及激發(fā)方法多種多樣。因此弄清小鼠哮喘模型制備方法與模型特點(diǎn)的聯(lián)系，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇實(shí)驗(yàn)所需的模型，合理選擇小鼠品系、過敏原及制作方案，是哮喘科研工作的首要任務(wù)。

1 常用小鼠品系

從20世紀(jì)60年代起，小鼠就開始應(yīng)用在哮喘研究領(lǐng)域。作為目前最常用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?00多個(gè)近交系可供挑選，常用的有BALB/c、C57BL/6、129Sv、A/J等。以哮喘和小鼠為主題詞檢索近10年P(guān)ubMed數(shù)據(jù)庫中所有關(guān)于哮喘和小鼠的文章，結(jié)果顯示從2003年9月1日至2013年9月1日采用小鼠制作哮喘模型的文獻(xiàn)約有14 814篇，其中使用BALB/c和C57BL/6制作哮喘模型比例分別占33.04%和23.75%，BALB/c使用頻率約為C57BL/6的1.4倍(圖1)。

圖1近10年P(guān)ubMed數(shù)據(jù)庫中采用各品系小鼠制作哮喘模型情況

Fig1ApplicationofvariousstrainsofmiceforasthmamodelinPubMeddatabaseduringthelastdecade

不同品系小鼠對(duì)致敏原敏感性不同，且抗原激發(fā)后過敏性炎癥表現(xiàn)不同(表 1)。在對(duì)不同致敏原反應(yīng)表現(xiàn)上C57BL/6小鼠對(duì)塵螨和豚草抗原反應(yīng)性較強(qiáng)；A/J小鼠對(duì)塵螨反應(yīng)性遠(yuǎn)高于卵白蛋白(ovalbumin，OVA)[6];129Sv對(duì)OVA以及呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)反應(yīng)性更強(qiáng)[7]，表現(xiàn)出明顯的Th2型免疫反應(yīng)并出現(xiàn)肺內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞浸潤；BALB/c小鼠較易產(chǎn)生針對(duì)OVA和花粉的氣道高反應(yīng)性[8]，但容易對(duì)長(zhǎng)期單一致敏原的霧化攻擊產(chǎn)生耐受，從而降低炎癥和氣道高反應(yīng)性表現(xiàn)[9]。

表1不同品系小鼠對(duì)常見致敏原的敏感性表現(xiàn)

Tab1Susceptibilityofdifferentstrainsofmicesensitizedbycommonallergens

致敏原BALB/cC57BL/6129SvA/JOVA++++++++++塵螨+++++/+++病毒++++/花粉+++++/++蟑螂++/+

注：+為出現(xiàn)，++為強(qiáng)烈，+++為劇烈，/為未報(bào)道

Note:+appear，++intense，+++severe，/unreported

在抗原致敏及激發(fā)后過敏性炎癥表現(xiàn)上BALB/c、C57BL/6和129Sv致敏后均可產(chǎn)生相應(yīng)的IgE抗體，但BALB/c小鼠總IgE量比后兩者少而特異性IgE量更多[10]，也有研究表明該模型可能存在非IgE依賴性哮喘通路[6]。BALB/c小鼠較易出現(xiàn)強(qiáng)烈的Th2型細(xì)胞因子免疫反應(yīng)，能產(chǎn)生廣泛肺嗜酸粒細(xì)胞浸潤[11]。C57BL/6小鼠致敏后產(chǎn)生的氣道高反應(yīng)性被認(rèn)為和嗜酸粒細(xì)胞血癥有關(guān)[12]。

目前研究認(rèn)為氣道高反應(yīng)性以及激發(fā)后氣道阻塞表現(xiàn)和基因相關(guān)度很高，而A/J小鼠在這方面表現(xiàn)比BALB/c、C57BL/6和129Sv更具有優(yōu)勢(shì)[13]，可能與白介素- 4(IL- 4)受體基因多態(tài)性有關(guān)[14]。在采用滴鼻激發(fā)制作的氣道高反應(yīng)性哮喘模型中，BALB/c、C57BL/6、129Sv對(duì)乙酰甲膽堿反應(yīng)性遠(yuǎn)不如A/J，但若改用霧化激發(fā)則結(jié)果又完全相反[15]，由此可見哮喘模型病理表現(xiàn)與制作方法相關(guān)性很高。

2 小鼠哮喘模型的致敏

致敏方法能夠影響宿主小鼠的免疫反應(yīng)，因此，合理地選擇一種模型需要綜合考慮致敏原和佐劑的類型、致敏方式以及致敏劑量。

2.1 常見致敏原

目前常用致敏原主要有OVA、塵螨、病毒、花粉、蟑螂變應(yīng)原等。

作為經(jīng)典的抗原，OVA具有免疫原性強(qiáng)、易于獲得、相關(guān)試劑選擇空間大等優(yōu)勢(shì)，常與非免疫原性佐劑聯(lián)合使用。用OVA聯(lián)合氫氧化鋁腹腔注射致敏129Sv小鼠，OVA生理鹽水溶液連續(xù)霧化激發(fā)后可得到以嗜酸粒細(xì)胞浸潤、氣道高反應(yīng)性為主要表現(xiàn)的急性炎癥型哮喘模型[16]。采用OVA和硫酸鋁鉀腹腔注射致敏3次，1周后連續(xù)滴鼻3次激發(fā)可制作過敏性哮喘模型，表現(xiàn)出明顯的氣道高反應(yīng)性[17]。

有文獻(xiàn)[18]報(bào)道，用塵螨比OVA制作的小鼠慢性哮喘模型表現(xiàn)出更持久的氣道高反應(yīng)性。給予屋塵螨致敏BALB/c小鼠，第10天用屋塵螨滴鼻激發(fā)可制作以變態(tài)反應(yīng)性炎癥為主要表現(xiàn)的過敏性哮喘模型[19]。給予屋塵螨滴鼻3～6周，每周3次可制作慢性過敏性哮喘模型，并且發(fā)現(xiàn)6周致敏后的總IgG1及IgE量高于3周致敏且氣道重塑表現(xiàn)更明顯[20]。持續(xù)給予屋塵螨滴鼻7周致敏BALB/c小鼠可制作氣道重塑模型，并出現(xiàn)明顯氣道嗜酸粒細(xì)胞炎癥和對(duì)乙酰甲膽堿的強(qiáng)烈氣道高反應(yīng)性表現(xiàn)[18]。雖然近年塵螨造模應(yīng)用增多，但塵螨不易提純，增加了劑量掌握的難度，應(yīng)用仍不及OVA廣泛。

RSV可作為抗原單獨(dú)致敏小鼠，也可聯(lián)合OVA用來制作重癥哮喘模型。采用紫外線滅活的RSV聯(lián)合氫氧化鋁皮下注射致敏小鼠，RSV滴鼻激發(fā)可制作以氣道黏膜下漿細(xì)胞及嗜酸粒細(xì)胞浸潤的哮喘模型[21]。而在OVA致敏的條件下，使用RSV誘導(dǎo)制作的急性病毒性哮喘模型比單純OVA或單純RSV致敏激發(fā)的哮喘模型病理變化更嚴(yán)重，表現(xiàn)出感染性炎癥和變態(tài)反應(yīng)性炎癥特征[22]。在OVA致敏條件下RSV感染可加重氣道炎癥，導(dǎo)致氣道上皮的破壞增生，這可能是其增高氣道高反應(yīng)性的機(jī)理之一[23]。

花粉是人類支氣管哮喘常見的過敏原，采用花粉致敏制作小鼠哮喘模型也能模擬哮喘實(shí)際發(fā)病情況[24]。有報(bào)道用柏樹花粉提取物聯(lián)合氫氧化鋁腹腔注射致敏2次，3周后滴鼻激發(fā)可制作出高濃度嗜酸粒細(xì)胞浸潤的變態(tài)反應(yīng)性炎癥模型，并出現(xiàn)Th2型細(xì)胞因子增多[25]。用樺樹花粉提取物聯(lián)合氫氧化鋁腹腔注射致敏2次，3周后連續(xù)霧化4天激發(fā)可成功制作過敏性哮喘模型，出現(xiàn)強(qiáng)烈的氣道高反應(yīng)性[26]。也有報(bào)道皮下注射橄欖花粉提取物和氫氧化鋁制作哮喘模型可表現(xiàn)出顯著Th2型免疫反應(yīng)[24]。但由于花粉種類繁多，而且存在地域差別，采用花粉制作的哮喘模型也多樣，使模型的重復(fù)和相互間比較研究復(fù)雜化。

除了花粉，蟑螂也和哮喘發(fā)病有密切關(guān)系。常見的德國小蠊和美洲大蠊體內(nèi)都存在多種潛在致敏原，有德國小蠊提取物Bla g2(失活天冬氨酸蛋白酶)、Bla g4(calycin)、Bla g 5(谷胱甘肽- S- 轉(zhuǎn)移酶)等，所以到目前為止國內(nèi)和國際對(duì)蟑螂變應(yīng)原所致哮喘都很難進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化研究[27- 28]。有報(bào)道示蟑螂提取物聯(lián)合弗氏完全佐劑腹腔注射致敏，第14天給予等量抗原液滴鼻激發(fā)，第20天氣管內(nèi)給予蟑螂變應(yīng)原可成功制作出顯著氣道高反應(yīng)性表現(xiàn)的過敏性哮喘模型[29]。每隔4 d滴鼻給予蟑螂提取物和不完全弗氏佐劑共5次，氣管內(nèi)給予蟑螂提取物2次激發(fā)可制作出重度氣道重塑表現(xiàn)的慢性過敏性哮喘模型[30]。

在眾多的哮喘模型中，不同致敏原基本都可以制作各種哮喘模型，但是每個(gè)致敏原也有自己本身的缺陷。比如單用OVA很難制作重癥哮喘模型，塵螨提純價(jià)格昂貴，病毒和真菌制作的哮喘模型雖為臨床中通過控制病原體感染而控制哮喘發(fā)生提供依據(jù)，但穩(wěn)定性欠佳，其在誘導(dǎo)哮喘發(fā)生中的作用還需進(jìn)一步闡明[31]。蟑螂變應(yīng)原、花粉及職業(yè)性致敏原等由于種類繁多、模型制作很難標(biāo)準(zhǔn)化而使模型的復(fù)制復(fù)雜化，故在制作哮喘模型中使用相對(duì)較少。

2.2 佐劑

哮喘致敏時(shí)常需聯(lián)合佐劑使用。佐劑可通過特異性或非特異性免疫增強(qiáng)作用使機(jī)體產(chǎn)生更多的抗體量，不僅可以減輕免疫耐受，還能節(jié)約使用的抗原量[32]。在哮喘模型的制作中最常用的是鋁化合物以及來源于病原微生物的佐劑，以氫氧化鋁和滅活百日咳桿菌多見。

作為最常用的佐劑，氫氧化鋁不僅可以增強(qiáng)免疫反應(yīng)，還可以增加Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生[33]，甚至影響激發(fā)前后宿主免疫反應(yīng)類型。使用劑量從1 mg到40 mg不等，最常用的劑量是2.25 mg。有報(bào)道示OVA聯(lián)合氫氧化鋁間隔7 d或者14 d的兩次致敏，可引起強(qiáng)烈Th2偏向的免疫反應(yīng)并產(chǎn)生高濃度的特異性IgE含量[34]。有研究示使用氫氧化鋁佐劑聯(lián)合OVA制作的哮喘模型表現(xiàn)出非IgE和非肥大細(xì)胞依賴的過敏性炎癥和氣道高反應(yīng)性，相反，不使用氫氧化鋁佐劑僅用OVA制作的哮喘模型則出現(xiàn)明顯的肥大細(xì)胞依賴性過敏性炎癥表現(xiàn)[35]。

關(guān)于百日咳桿菌佐劑，有報(bào)道比較采用單純百日咳桿菌、OVA聯(lián)合百日咳桿菌及單純OVA致敏小鼠制作哮喘模型，發(fā)現(xiàn)百日咳桿菌雖然可通過引起Th1型免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)Th2型免疫反應(yīng)，但仍然可加重哮喘模型病理表現(xiàn)、氣道炎癥以及氣道高反應(yīng)性[36]。

2.3 致敏方式及致敏原劑量

致敏方式在一定程度上影響小鼠免疫反應(yīng)。致敏方式主要有腹腔注射、霧化吸入、皮下注射、鼻內(nèi)給藥、氣管內(nèi)給藥等,目前最常用的致敏方式是腹腔注射致敏原加佐劑。Secor等[37]用OVA聯(lián)合氫氧化鋁腹腔注射致敏C57BL/6小鼠，成功制作了急性過敏性哮喘模型。此外，僅用吸入致敏原的方式也可以成功制作過敏性哮喘模型。Larsen等[38]用霧化吸入OVA致敏BALB/c小鼠，每天20 min，連續(xù)10 d，制作了最短時(shí)間的氣道高反應(yīng)性模型，并出現(xiàn)高濃度特異性IgE。此外，皮下多點(diǎn)注射、鼻內(nèi)給藥及氣管內(nèi)給藥等方式制作的哮喘模型也可達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹orry等[39]采用皮下注射OVA混合氫氧化鋁，制作了急性氣道高反應(yīng)性模型。Johnson等[18]采用HDM滴鼻BALB/c小鼠7周，每周5次制作出有明顯氣道嗜酸粒細(xì)胞炎癥、對(duì)乙酰甲膽堿的強(qiáng)烈氣道高反應(yīng)性表現(xiàn)的氣道重塑模型。采用屋塵螨氣管內(nèi)給藥致敏BALB/c小鼠，可成功制作變態(tài)反應(yīng)性炎癥表現(xiàn)的過敏性哮喘模型[19]。根據(jù)模型需要，也有多次致敏和單次致敏的區(qū)別。采用隔天腹腔注射粉塵螨聯(lián)合氫氧化鋁6次，可成功制作肺部變態(tài)反應(yīng)性炎癥哮喘模型[40]。

在模型制作過程中，不同抗原劑量影響肺泡灌洗液中嗜酸粒細(xì)胞數(shù)量、IgE含量、炎癥程度以及氣道高反應(yīng)性表現(xiàn)[41]。在腹腔注射致敏制作的小鼠哮喘模型中，OVA致敏劑量通常在1～20000 μg，其中10～50 μg使用范圍較常見[34]。有報(bào)道采用0、10、100、1000 μg OVA分別致敏小鼠，發(fā)現(xiàn)10 μg組產(chǎn)生以IgE為主的特異性抗體，且脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th2型細(xì)胞因子增加明顯，1 000 μg組產(chǎn)生以IgG2a為主的特異性抗體，Th1型細(xì)胞因子增多；而且氣道高反應(yīng)性只在10 μg OVA致敏的小鼠模型中出現(xiàn)[42]。此外，用0、3、30、300μg·ml-1的屋塵螨連續(xù)霧化制作氣道高反應(yīng)性小鼠模型，發(fā)現(xiàn)300μg·ml-1組出現(xiàn)氣道高反應(yīng)性以及大量炎癥細(xì)胞浸潤，血清IgE升高，但3μg·ml-1和30μg·ml-1組僅出現(xiàn)氣道高反應(yīng)性及血清IgE升高，并無氣道炎癥[43]。目前認(rèn)為致敏原的劑量可能通過影響細(xì)胞因子的類型，從而影響動(dòng)物模型表型的變化[44]。

3 小鼠哮喘模型的激發(fā)

模型的多樣性部分程度取決于激發(fā)的途徑、方法以及持續(xù)時(shí)間。激發(fā)方式常見的有霧化、鼻內(nèi)給藥及氣管內(nèi)給藥。其中霧化激發(fā)小鼠狀態(tài)較好，激發(fā)致死率低，使用最廣泛。

急性模型多采用連續(xù)4～8 d的霧化吸入激發(fā)，模型多可表現(xiàn)出嗜酸粒細(xì)胞浸潤及氣道高反應(yīng)性。變態(tài)反應(yīng)性炎癥哮喘模型制備中致敏和激發(fā)兩階段持續(xù)時(shí)間比較短，激發(fā)時(shí)間在兩周左右。抗原系統(tǒng)致敏及反復(fù)較長(zhǎng)時(shí)間的同一抗原激發(fā)對(duì)小鼠氣道重塑模型的建立是必需的，抗原激發(fā)可持續(xù)亦可間斷進(jìn)行，激發(fā)時(shí)間多超過3周[31](圖2)。

圖2小鼠哮喘模型制備過程激發(fā)時(shí)間與特征聯(lián)系

Fig2Relationshipbetweenchallengetimeandfeaturesinmurineasthmamodelpreparation

在探討不同激發(fā)方式對(duì)小鼠過敏性哮喘模型影響實(shí)驗(yàn)中，采用同樣致敏方法3次滴鼻激發(fā)和3次霧化激發(fā)制作的哮喘模型都可以表現(xiàn)出明顯氣道炎癥、嗜酸粒細(xì)胞浸潤，但滴鼻激發(fā)建立的哮喘模型比霧化激發(fā)表現(xiàn)更顯著[45]。有報(bào)道示霧化激發(fā)比滴鼻激發(fā)更易產(chǎn)生氣道高反應(yīng)性[46]。采用同樣致敏方法，氣管內(nèi)給藥制作的哮喘模型表現(xiàn)出氣道及肺組織炎癥、杯狀細(xì)胞增生、上皮細(xì)胞增生以及輕度的上皮組織纖維化，而霧化激發(fā)建立的哮喘模型則出現(xiàn)明顯氣道高反應(yīng)性并伴有顯著嗜酸粒細(xì)胞浸潤[15]。

4 總 結(jié)

綜上所述，小鼠哮喘模型制作方法多種多樣，在哮喘研究中提供了多種思路和方法，目前常用的變態(tài)反應(yīng)性炎癥哮喘模型、氣道重塑模型、重癥哮喘模型等都在一定程度上模擬了人類哮喘的發(fā)生、發(fā)展過程(表2)。根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的小鼠品系及制作方案，尋找更加理想的研究平臺(tái)，為研究哮喘病理生理機(jī)制提供針對(duì)性依據(jù)仍然是當(dāng)前的重點(diǎn)問題。

此外，小鼠哮喘模型的制備方法與模型的病理表現(xiàn)直接相關(guān)，所以系統(tǒng)的對(duì)比研究不同品系、不同致敏及激發(fā)方式與哮喘模型的聯(lián)系很有必要。隨著小鼠哮喘模型越來越廣泛的應(yīng)用，造模方法、生物技術(shù)等將不斷完善，對(duì)小鼠哮喘模型進(jìn)行客觀認(rèn)識(shí)及評(píng)價(jià)，深入比較研究不同方法制作的小鼠哮喘模型的特征，將使得制備的小鼠哮喘模型更加貼近人類哮喘表現(xiàn)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步為哮喘的發(fā)病機(jī)制及治療提供依據(jù)。

表2 3類主要的小鼠哮喘模型特征與人類哮喘的特征區(qū)別

Tab2Thecharacteristicsthatdistinguishthreemainmurineasthmamodelswithhumanasthma

特征人類哮喘變態(tài)反應(yīng)性炎癥哮喘模型氣道重塑模型重癥哮喘模型支氣管炎癥表現(xiàn)[34]+++++++-++嗜酸粒細(xì)胞性炎癥+++++++-+BALF中Th2細(xì)胞數(shù)量+++++++++對(duì)組胺的反應(yīng)+---對(duì)白三烯的反應(yīng)+---氣道高反應(yīng)性[34]++-+肺組織慢性炎癥+++-++++++氣道上皮細(xì)胞改變++-+++氣道平滑肌增生+++-++++氣道重塑[34]+++-++++++

注：+為出現(xiàn)，++為強(qiáng)烈，+++為劇烈，++++為顯著，- 為不出現(xiàn)

Note:+appear，++intense，+++severe，++++marked，- not appear

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