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    細(xì)胞穿膜肽抗人膀胱癌單克隆抗體載絲裂霉素白蛋白納米微球三聯(lián)體的靶向性和穿膜活性研究

    2014-09-12 02:47:58李云龍嚴(yán)春寅李巧星王偉錄王勇鄭紅芳周潔
    關(guān)鍵詞:離心管微球膀胱癌

    李云龍,嚴(yán)春寅,李巧星,王偉錄,王勇,鄭紅芳,周潔

    (1.江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院 泌尿外科,江蘇 昆山 215300; 2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 泌尿外科,江蘇 蘇州 215000; 3.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 泌尿外科,廣西 南寧 530021)

    細(xì)胞穿膜肽(TAT-EGFP)是一種能夠促進(jìn)多種物質(zhì)穿過細(xì)胞膜的小分子多肽,白蛋白載藥微球具有載藥量大、緩慢釋放和無毒等特性,單克隆抗體能夠?qū)崿F(xiàn)特異性靶向結(jié)合作用。結(jié)合以上三者的長處,建立TAT-EGFP-膀胱癌單克隆抗體(BDI-1)-載藥白蛋白納米微球(MMC-Ns)三聯(lián)體TAT-EGFP-BDI-1-MMC-Ns,可以實現(xiàn)藥物緩釋、靶向、促進(jìn)藥物內(nèi)化進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞內(nèi)化療,從而達(dá)到高效低毒的治療效果。有關(guān)三聯(lián)體對人膀胱癌細(xì)胞系EJ細(xì)胞靶向結(jié)合及穿膜活性的研究,國內(nèi)外均未見報道。作者就TAT-EGFP-BDI-1-MMC-Ns三聯(lián)體對EJ細(xì)胞靶向結(jié)合及其穿膜活性的研究報道如下。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試劑與材料

    TAT-EGFP(本課題組構(gòu)建制備),MMC-NS(本課題組采用交聯(lián)固化法制備),N-琥珀酰亞胺基-3-(2-毗啶基二琉)丙酸脂(SPDP, Sigma公司),二硫蘇糖醇(DTT,德國Meek公司),Amiga Uhm-15超濾離心管((Millipom公司),DyLightTM549標(biāo)記的羊抗小鼠IgG (H+L)抗體(EarthOx公司),BDI-1(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院饋贈)。

    1.1.2 主要儀器

    高速臺式低溫離心機(jī)(美國BIO-BAD公司),OLYMPUS熒光顯微鏡(日本),激光共聚焦顯微鏡(LSCM,F(xiàn)V100 IX81,德國OLYMPUS公司),JEOL掃描電鏡JSM-T300型(日本),透視電子顯微鏡(TEM,日本JEO公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 慢病毒紅色熒光蛋白感染EJ細(xì)胞

    實驗前1 d,接種1×105個EJ細(xì)胞及293 T細(xì)胞于12孔培養(yǎng)板中,第2天細(xì)胞貼壁后,每孔換成1 ml新鮮1640完全培養(yǎng)基,加入0.5 μl聚凝胺(polybrene)混勻,按MOI高低組加入不同量病毒,進(jìn)行病毒感染。取-70 ℃保存的病毒在冰上融化,無菌操作。在目的細(xì)胞和對照細(xì)胞中分別加入50 μl HBSS液稀釋好的病毒,培養(yǎng)液總體積為1 000 μl,加入病毒后輕輕晃動培養(yǎng)板,混勻后置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。如慢病毒對細(xì)胞有明顯毒性作用,在感染8~12 h后,更換新鮮完全培養(yǎng)基(1 600 μl·孔-1)后繼續(xù)培養(yǎng),如果有絮狀沉淀先用D-Hanks液洗滌;如慢病毒對細(xì)胞沒有明顯毒性作用,4~6 h后補(bǔ)加入600 μl完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

    1.2.2 TAT-EGFP-BDI-1-MMC-Ns三聯(lián)體的制備

    應(yīng)用異型雙功能交聯(lián)劑SPDP的一次偶聯(lián)法,進(jìn)行蛋白間的連接,進(jìn)行TAT-EGFP、BDI-1、MMC-Ns連接制備三聯(lián)體。

    1.2.2.1 制備TAT-EGFP(M=31 kD)的SPDP衍生物TAT-EGFP-PDP (1) 先將453 μg SPDP以無水乙醇溶解,再用0.22 μm微孔濾膜過濾。將凍干無菌的融合蛋白TAT-EGFP 1.5 mg,溶于2 ml 0.01 mol·L-1PBS(pH 7.5)中,在超凈臺內(nèi)共同加入無菌小燒杯中,投料摩爾比SPDP∶TAT-EGFP=20∶1,磁力攪拌器室溫攪拌反應(yīng)30 min。(2) 攪拌后出現(xiàn)少量沉淀,10 000 r·min-1離心30 s;(3) 取上清,加pH 7.5、0.02 mol·L-1無菌PBS緩沖液10~12 ml,一同加至經(jīng)體積分?jǐn)?shù)75%酒精浸泡消毒的超濾離心管中,3 500×g、4 ℃離心15 min;(4) 重復(fù)步驟(3)3次,以去除多余的SPDP;(5) 所得超濾離心管中的液體即為TAT-EGFP-PDP,將液體濃縮至2.0 ml。

    1.2.2.2 制備蛋白微球的SPDP衍生物MMC-NS-PDP (1) 經(jīng)60Co輻照滅菌的MMC-NS 5 mg,溶于2 ml pH 7.5、0.01 mol·L-1無菌PBS緩沖液中,與經(jīng)0.22 μm微孔濾膜先濾過除菌的466 μg SPDP(無水乙醇溶解,現(xiàn)用現(xiàn)配)共同加入小燒杯中,投料摩爾比SPDP∶MMC-NS=20∶1,室溫攪拌反應(yīng)30 min;(2) 攪拌后出現(xiàn)少量沉淀,10 000 r·min-1離心30 s;(3) 取沉淀,加pH 7.5、0.02 mol·L-1無菌PBS緩沖液1 ml混勻,12 000 r·min-1,離心2 min;(4) 重復(fù)步驟(3)3次,以去除多余的SPDP;(5)取沉淀即為MMC-NS-PDP,將其均勻分散于pH 7.5、0.02 mol·L-1無菌PBS緩沖液中。

    1.2.2.3 制備BDI-1的SPDP衍生物BDI-1-PDP (1) 以0.22 μm微孔濾膜先濾過227 μg SPDP,再濾過膀胱癌單克隆抗體(BDI-1)0.025 ml,用2 ml pH 7.5、0.01 mol·L-1PBS稀釋,在超凈臺內(nèi)共同加入無菌小燒杯中,投料摩爾比SPDP∶TAT=20∶1,磁力攪拌器室溫攪拌反應(yīng)30 min;(2) 攪拌后出現(xiàn)少量沉淀,10 000 r·min-1離心30 s;(3) 取上清,加pH 4.5、0.01 mol·L-1醋酸鹽(含0.15 mol·L-1NaCl)緩沖液10~12 ml,一同加入至超濾離心管中,3 500×g、4 ℃離心15 min;(4) 重復(fù)步驟(3)3次,以去除多余的SPDP;(5) 所得的超濾離心管中的液體即為BDI-1-PDP,將液體分散于無菌醋酸鹽緩沖液(pH 4.5)中濃縮至1.0 ml。

    1.2.2.4 BDI-1-SH的制備 在超濾濃縮至1 ml的BDI-1-PDP醋酸鹽緩沖液(pH 4.5)中,加入15.4 mg DTT,再經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過除菌,使反應(yīng)體系中DTT終濃度為50 mmol·L-1,室溫輕輕攪拌30 min;攪拌后出現(xiàn)少量沉淀,10 000 r·min-1離心30 s;取上清,加pH 7.5、0.02 mol·L-1無菌PBS緩沖液10~12 ml,一同加入至超濾離心管中,3 500×g、4 ℃離心15 min;重復(fù)步驟(3)3次,以去除多余的DTT;所得的超濾離心管中的液體即為BDI-1-SH,加入pH 7.5、0.02 mol·L-1無菌PBS緩沖液中,將液體濃縮至2.0 ml。

    1.2.2.5 制備TAT-EGFP-BDI-1-MMC-NS三聯(lián)偶聯(lián)物 將上述所得到的0.75 mg·ml-1的TAT-EGFP-PDP、2.5 mg·ml-1的MMC-NS-PDP和1 mg·ml-1的BDI-1-SH各2 ml混合,加入至同一個經(jīng)高壓滅菌的小燒杯室溫攪拌30 min,將混合液倒入用經(jīng)滅菌的小燒杯,用消毒后的錫箔紙遮蓋杯口,置于外罩一個大一號的經(jīng)滅菌燒杯置于4 ℃、磁力攪拌器低速攪拌過夜(≥16 h);將上步(2)中過夜攪拌中的液體15 000 r·min-1離心45 s,取沉淀用pH 7.5、0.02 mol·L-1無菌PBS離心洗滌3~4次,沉淀即為目的三聯(lián)偶聯(lián)物TAT-EGFP-BDI-1-MMC-NS。

    1.2.3 激光共聚焦圖像顯微鏡檢測三聯(lián)體的連接情況

    取對數(shù)生長期EJ細(xì)胞并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×105個·ml-1,置培養(yǎng)皿中培養(yǎng)并進(jìn)行爬片,6 h后PBS洗滌3次,加入200 μl無血清培養(yǎng)液,置于37 ℃的載物臺上,調(diào)整激光共聚焦顯微鏡光電倍增管電壓值,使細(xì)胞圖像達(dá)到最清晰。

    1.2.4 電子顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡檢測三聯(lián)體圖像的分析

    取用同種培養(yǎng)液培養(yǎng)的同一批細(xì)胞,用同一批制備的三聯(lián)體微球在同一時間分別進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡和電子顯微鏡檢查。

    2 結(jié) 果

    2.1 慢病毒紅色熒光蛋白感染人膀胱癌細(xì)胞株EJ人膀胱癌細(xì)胞

    見表1。

    表1加入病毒的滴度、MOI及體積

    病毒滴度/TU·ml-1病毒加入量/μl感染體積/ml高M(jìn)OI2.00E+09101低MOI2.00E+09201

    2.2 三聯(lián)體靶向結(jié)合的監(jiān)測

    2.2.1 激光共聚焦顯微鏡示三聯(lián)體與人膀胱癌EJ細(xì)胞靶向結(jié)合

    見圖1。

    圖1三聯(lián)體與EJ細(xì)胞靶向結(jié)合三聯(lián)體與轉(zhuǎn)染了紅色熒光蛋白的膀胱癌EJ(t)(紅色)連接

    2.2.2 掃描電鏡示單純微球和三聯(lián)體與EJ人膀胱癌細(xì)胞的結(jié)合情況

    見圖2。

    圖2三聯(lián)體與EJ人膀胱癌細(xì)胞的結(jié)合三聯(lián)體靶向與EJ細(xì)胞結(jié)合,掃描電鏡可見腫瘤細(xì)胞表面突起和微絨毛明顯減少

    2.3 三聯(lián)體穿膜活性監(jiān)測

    2.3.1 激光共聚焦顯微鏡和透射電鏡對三聯(lián)體穿膜活性的監(jiān)測

    見圖3。

    圖3三聯(lián)體穿膜活性的監(jiān)測三聯(lián)體內(nèi)化入EJ人膀胱癌細(xì)胞,透射電鏡可見載絲裂霉素納米微球進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部

    2.3.2 三聯(lián)體穿膜活性的動態(tài)監(jiān)測

    見圖4。

    2.3.3 透射電鏡EJ人膀胱癌細(xì)胞膜微絨毛監(jiān)測

    見圖5。

    圖4三聯(lián)體穿膜活性的動態(tài)監(jiān)測內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的微球輪廓清晰可見,同時可見細(xì)胞表面微絨毛全部消失

    圖5EJ人膀胱癌細(xì)胞膜微絨毛監(jiān)測EJ人膀胱癌細(xì)胞內(nèi)穿入多個載白蛋白納米微球,細(xì)胞核固縮,細(xì)胞凋亡,穿入微球側(cè)向外凸起,同時見細(xì)胞表面突起減少、微絨毛消失

    3 討 論

    本研究是在課題組前期成功構(gòu)建融合蛋白穿膜肽-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)、表達(dá)純化及鑒定融合蛋白TAT-EGFP活性基礎(chǔ)上的進(jìn)一步探索。TAT-EGFP能夠促進(jìn)多種物質(zhì)通過細(xì)胞膜,攜帶小分子蛋白、藥物分子、抗體和微粒等多種物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部[1-2]。納米藥物應(yīng)用的關(guān)鍵之一是納米載體的設(shè)計與研發(fā)[3],白蛋白微球是目前較成熟的一類微球,具有載藥量大、緩慢釋放藥物等特性[4-5]。單克隆抗體能夠?qū)崿F(xiàn)特異性靶向結(jié)合與殺傷作用[6]。膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤[7],70%~80%為淺表性膀胱癌[8]。北京大學(xué)謝蜀生教授課題組針對膀胱癌細(xì)胞建株的雜交瘤細(xì)胞株能夠穩(wěn)定分泌單抗BDI-1,可特異性結(jié)合EJ人膀胱癌細(xì)胞,已經(jīng)證實該抗體作用于腫瘤細(xì)胞膜上的兩個分別為53 kb和54 kb長度的膜表面蛋白,并證實其對包括炎癥細(xì)胞和正常移形上皮在內(nèi)的其他細(xì)胞沒有交叉結(jié)合[9]。

    目前已有一系列異型雙功能交聯(lián)試劑用于蛋白質(zhì)間的交聯(lián),可以實現(xiàn)控制交聯(lián),提高交聯(lián)反應(yīng)的選擇性和交聯(lián)產(chǎn)物的均一性[10]。SPDP已經(jīng)成功應(yīng)用于多種腫瘤特異性的免疫毒素、免疫微球等抗體導(dǎo)向藥物系統(tǒng)的制備[11-13]。其交聯(lián)原理:SPDP與蛋白質(zhì)中的伯氨基反應(yīng),分別引入吡啶二硫基,將其中1種含吡啶二硫基的蛋白質(zhì)用DTT還原成巰基,然后在含吡啶二硫基的蛋白質(zhì)與含巰基的蛋白質(zhì)之間,通過巰基與二硫鍵的交換,進(jìn)行蛋白質(zhì)間偶聯(lián)。本實驗中使用SPDP連接蛋白,具體操作步驟:第1步,將TAT-EGFP、MMC-NS、BDI-1各自與SPDP反應(yīng)引進(jìn)吡啶二硫基(PDP基團(tuán)),SPDP衍生物分別為TAT-EGFP-PDP、BDI-1-PDP、MMC-NS-PDP;第2步,用DTT將BDI-1-PDP還原成BDI-1-SH;第3步,將TAT-EGFP-PDP、MMC-NS-PDP和BDI-1-SH反應(yīng)得到本實驗的目的產(chǎn)物TAT-EGFP-BDI-1-MMC-NS。實驗過程中需要注意的是:SPDP很容易因吸水而失活,所以根據(jù)用量分裝后干燥密封存放;反應(yīng)中SPDP、DTT都是過量的,以保證完全反應(yīng),并用相應(yīng)的方法除去雜質(zhì)。

    為了進(jìn)一步標(biāo)記鑒別TAT-EGFP-BDI-1-MMC-NS三聯(lián)體的靶向結(jié)合,我們用慢病毒對人膀胱癌EJ細(xì)胞轉(zhuǎn)染了紅色熒光蛋白基因,用表達(dá)的紅色熒光蛋白標(biāo)記EJ細(xì)胞,用其攜帶紅色熒光在激光共聚焦顯微鏡下顯示紅色,BDI-1抗體結(jié)合抗鼠的二抗顯示黃色,微球結(jié)合帶有綠色熒光的TAT-EGFP顯示綠色,可進(jìn)一步證明了三聯(lián)偶聯(lián)物中抗體的存在。

    本實驗成功制備了三聯(lián)偶聯(lián)物TAT-EGFP-BDI-1-MMC-NS,并進(jìn)行了初步鑒定,為下一步進(jìn)行體內(nèi)、體外的實驗奠定了基礎(chǔ),也為膀胱腫瘤的治療以及更多其它腫瘤的治療提供了新的思路,開辟了新的方向。同時,本實驗首次在電鏡下觀測到腫瘤細(xì)胞膜表面微絨毛在三聯(lián)體內(nèi)化入腫瘤細(xì)胞后消失的現(xiàn)象,其機(jī)制有待后續(xù)實驗進(jìn)一步研究。

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