健胃消食片對(duì)滯脾礙胃大鼠脂肪組織脂聯(lián)素表達(dá)的影響

林 斌 馮偉峰 孫升云

(梅州市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)科，廣東 梅州 514011)

中醫(yī)認(rèn)為滯脾礙胃多為后天喂養(yǎng)失和，過食肥甘厚味，臟腑失調(diào)，脾胃虛弱，食滯化熱所致，病變臟腑在脾胃，發(fā)病機(jī)制在于脾運(yùn)胃納功能的失常。在中醫(yī)臨床運(yùn)用方面，醒脾為治療大法，健胃則是治療的關(guān)鍵，兩者配合，可以取得較好的療效。健胃消食片由太子參、陳皮、山藥、麥芽(炒)和山楂5味中藥材制備而成，有健胃消食的功效，用于脾胃虛弱，消化不良等癥，收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十六冊〔1〕。本實(shí)驗(yàn)觀察健胃消食片對(duì)脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 YP601N型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，-80℃超低溫冰箱(SANYO公司)，全自動(dòng)生化分析儀(日本Olympus公司)，臺(tái)式高速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)，冷凍離心機(jī)(Beckman公司)，微量加樣器(德國Eppendorf公司)，Trirol試劑、DEPC 和Taq酶(均為TaKaRa公司)，乙醇、異丙醇和氯仿(均為廣州化學(xué)試劑廠)，Reverse Transcriptase、Rnase Inhibitor、5×Reaction Buffer、Random Primers、10×PCR Buffer和dNTP(均為TIANGEN公司)，UNOⅡ型PCR擴(kuò)增儀(Biometra公司)，DNA Marker(北京鼎國生物技術(shù)有限公司)，瓊脂糖粉(Sigma公司)，數(shù)據(jù)處理與分析系統(tǒng)及凝膠分析系統(tǒng)(Kodak公司)，脂聯(lián)素引物和β-actin引物(均為廣州達(dá)安臨床檢驗(yàn)中心有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 健胃消食片(江中藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字：Z20013220，產(chǎn)品批號(hào)：0611710)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠60只，雌雄各半，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(粵)2007-0002。

1.4飼料配制 基礎(chǔ)飼料：購自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心； 特制高脂飼料配方：豬油∶奶粉∶魚松∶豆粉∶玉米粉∶白糖∶鮮雞蛋按照2∶1∶1∶2∶1∶1∶1.8的比例進(jìn)行配制。其中，奶粉、魚松、豆粉、玉米粉、白糖和鮮雞蛋(市售)，豬油(紅楓葉牌)批號(hào)：20070113，購于廣州加益食品有限公司，于暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心加工。

1.5動(dòng)物分組和模型建立 60只SD大鼠隨機(jī)分為空白組(n=18)和造模組(n=42)，其中空白組進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)飼料，造模組給予特制高脂飼料喂飼。4 w后，以食量低于對(duì)照組平均食量20%和體重低于對(duì)照組平均體重20%為滯脾礙胃模型大鼠標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)組中有36只大鼠符合標(biāo)準(zhǔn)。滯脾礙胃大鼠隨機(jī)分為健胃消食組及高脂對(duì)照組各18只，健胃消食組除高脂飼養(yǎng)外，于每日上午予灌服健胃消食片0.72 g/kg，高脂對(duì)照組繼續(xù)高脂飼養(yǎng)，空白組大鼠正常喂飼，共進(jìn)行4 w。

1.6實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測定

1.6.1體重和食量測定 每周用電子天平測體重(精確到0.1 g)一次，同時(shí)每周計(jì)算并記錄每組的平均食量(精確到0.01 g)。大鼠的平均食量為每組大鼠每只的平均值，合籠喂養(yǎng)，食量是每天平均耗食量。

1.6.2谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測定 用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，取腹部脂肪組織分別稱取濕重。打開腹腔，自腹主動(dòng)脈直接采血4～6 ml，裝入抗凝管，分離血清，以全自動(dòng)生化分析大鼠血清AST、ALT的含量。

1.6.3脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá) 取脂肪組織100～150 mg，Trizol一步法提取總RNA。提取后-80℃保存。取RNA樣品用紫外分光光度儀測定樣品在260 nm波長下的光密度吸收值(A260)，計(jì)算其濃度及含量。RNA濃度(μg/μl)=A260×40×稀釋倍數(shù)/1 000。RNA樣品經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳1 h，在凝膠紫外透視儀下可觀察到兩條清晰的條帶，說明所提取的RNA完整無降解。取RNA樣本3 μl，通過逆轉(zhuǎn)錄方法，將RNA還原成cDNA，放入-20℃冰箱保存。總反應(yīng)體積為25 μl，采用合適的反應(yīng)體系，其中脂聯(lián)素上游引物(5′-CAG GAG ATG CTG GAA TGA CAG G-3′),脂聯(lián)素下游引物(5′-CGT AGG TGA AGA GAA CGG CCT T-3′)，擴(kuò)增產(chǎn)物為321 bp；β-actin上游引物(5′-CTC TGG TCG TAC CAC TGG CAT T-3′)，β-actin下游引物(5′-TCC TGC TTG CTG ATC CAC ATC-3′)，擴(kuò)增產(chǎn)物為651 bp；在冰上操作，脂聯(lián)素mRNA和內(nèi)標(biāo)β-actin同管擴(kuò)增。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10 μl PCR產(chǎn)物，加1.5%瓊脂糖上電泳，電泳緩沖液為0.1×TAE，電泳電流100 mA，時(shí)間為30 min。紫外監(jiān)測儀下攝片，用圖像掃描儀對(duì)底片進(jìn)行灰度掃描，凝膠電泳分析軟件分析。以脂聯(lián)素mRNA與β-actin電泳條帶灰度值之比(脂聯(lián)素mRNA/β-actin)作為反映脂聯(lián)素mRNA表達(dá)的相對(duì)指標(biāo)。

2 結(jié) 果

2.1造模4 w過程中高脂及普通飼料喂養(yǎng)大鼠的平均食量及體重變化 予以特制高脂飼料喂養(yǎng)的SD大鼠表現(xiàn)為食欲下降，食量減少，體重下降。至4 w時(shí)，兩組大鼠的平均食量比較有明顯差異(P<0.05)，見表1。兩組大鼠的體重有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，見表2。本結(jié)果說明用特制高脂飼料造滯脾礙胃大鼠模型4 w成模。

2.2健胃消食片對(duì)實(shí)驗(yàn)性滯脾礙胃大鼠肝功水平的影響 高脂對(duì)照組和健胃消食組大鼠血清肝功能AST、ALT水平無明顯變化，與空白組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。健胃消食組大鼠與高脂對(duì)照組大鼠相比，其血清AST、ALT水平與高脂對(duì)照組無明顯差異(P>0.05)。見表3。

2.3健胃消食片對(duì)滯脾礙胃大鼠脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)的影響 與空白組比較，高脂對(duì)照組大鼠脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)明顯升高(0.328±0.016 vs 0.18±0.017，P<0.05)，而健胃消食片組大鼠脂肪組織脂聯(lián)素mRNA的表達(dá)水平低于高脂對(duì)照組大鼠(0.275±0.022，P<0.05)。見圖1。

表1 高脂及普通飼料喂養(yǎng)大鼠的平均食量變化

表2 高脂及普通飼料喂養(yǎng)大鼠的體重變化

表3 健胃消食片對(duì)大鼠肝功能水平的影響

圖1 各組脂聯(lián)素mRNA和β-actin的電泳條帶圖

3 討 論

用含豬油20%的飼料喂養(yǎng)大鼠，大鼠食量減少〔2〕。本實(shí)驗(yàn)在配制飼料的過程中增加了豬油的含量，目的就是增加出現(xiàn)飲食誘導(dǎo)滯脾礙胃大鼠的百分比，結(jié)果證明此方法行之有效。

本實(shí)驗(yàn)中滯脾礙胃大鼠模型的肝功能是正常的，即給予特制高脂飼料8 w對(duì)SD大鼠的血清AST、ALT水平無影響，可能是因?yàn)檫M(jìn)食量明顯降低，進(jìn)食高脂飼料很少，對(duì)SD大鼠肝功能未造成損害。本實(shí)驗(yàn)還表明健胃消食片沒有肝功能損害。

脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的蛋白激素，其編碼基因是代謝綜合征(MS)的易感位點(diǎn)〔3〕。其基因定位于人類染色體3q27，是調(diào)節(jié)代謝綜合征病理過程的中心環(huán)節(jié)〔4〕，Scherer等〔5〕首先從鼠的脂肪細(xì)胞中分離出來的一種蛋白質(zhì)。脂聯(lián)素具有改善胰島素抵抗(IR)、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用〔6〕。血漿脂聯(lián)素水平與胰島素敏感性呈正相關(guān)，與體重指數(shù)(BMI)、體脂百分比(BF%)呈負(fù)相關(guān)，肥胖特別是內(nèi)臟脂質(zhì)增多的患者血漿脂聯(lián)素水平降低，體重減輕后脂聯(lián)素水平會(huì)回升，IR也明顯改善〔7〕。

據(jù)報(bào)道，在嚙齒類動(dòng)物，急性注射脂聯(lián)素可減少肝臟葡萄糖輸出，在體內(nèi)脂聯(lián)素還可減少肌肉和肝臟甘油三酯含量，同時(shí)上調(diào)涉及脂肪酸氧化的基因的表達(dá)，增加脂肪酸氧化的作用〔8〕。本實(shí)驗(yàn)說明健胃消食片可以減少滯脾礙胃大鼠脂肪組織脂聯(lián)素mRNA的表達(dá)水平，減少脂肪酸氧化。

4 參考文獻(xiàn)

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8Yamauchin T，Kamon J，Waki H，etal.The fat-derived hormone adiponectin reverses insulin resistance associated with both lipoatrophy and obesity〔J〕.Nat Med，2001；7(8)：941-6.