丹黃通絡(luò)膠囊對自然衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

張小毅 李生瑩 劉巨源 楊宇平 詹合琴

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

丹黃通絡(luò)膠囊是經(jīng)現(xiàn)代科學(xué)工藝加工生產(chǎn)的一種中藥復(fù)方制劑，具有“活血化瘀、益氣通絡(luò)、滋補(bǔ)肝腎”等作用，對改善老年腦血管病變和延緩衰老有較好療效〔1〕。隨著全球人口老齡化的程度加快，老年性癡呆的發(fā)病率逐年上升，已成為繼心臟病、腫瘤和腦卒中之后的第4大殺手，但其病因、發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，缺乏有效的西醫(yī)治療措施，因此開發(fā)利用中藥復(fù)方，發(fā)揮中醫(yī)優(yōu)勢來治療該病就十分重要。本研究以丹黃通絡(luò)膠囊為載體，通過觀察其對自然衰老模型大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 5月齡和20～24月齡健康Wistar大鼠，雌雄各半，體重分別為250～260 g、400～500 g，由貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：SCXK(黔)2002-0001。

1.2藥品與主要試劑 丹黃通絡(luò)膠囊(DHTL)：0.48 g/粒，含原生藥1.6 g/粒，批號：050526，貴陽天陽生物技術(shù)開發(fā)有限公司；Aβ1～40單克隆抗體：美國Sigma公司；膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)檢測試劑盒和乙酰膽堿酯酶(AchE)檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.3主要儀器 Morris水迷宮系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；721分光光度計(jì)(北京光學(xué)儀器廠)；Biomias99圖像分析系統(tǒng)(四川大學(xué)圖像圖形研究所)。

1.4動物分組與給藥 適應(yīng)環(huán)境1 w后，取Wistar大鼠進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練，淘汰掉學(xué)習(xí)成績太好(逃避潛伏期≤5 s)和太差(逃避潛伏期≥40 s)者，其余納為合格大鼠。將篩選合格的10只5月齡Wistar大鼠作為青年對照組，40只20～24月齡Wistar大鼠隨機(jī)分為老年模型組、DHTL低、中、高劑量組(0.16，0.32，0.64 g/kg)，每組10只。除青年對照組和老年模型組給予等容量蒸餾水外，其余各給藥組按既定劑量灌胃給藥，1次/d，連續(xù)60 d。

1.5Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 各組大鼠在藥物干預(yù)結(jié)束后開始水迷宮實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)歷時4 d，每天分上、下午兩個時間段，每個時間段訓(xùn)練2次，將大鼠面向池壁放入水中，記錄120 s內(nèi)尋找平臺所需時間(逃避潛伏期)。如果大鼠在120 s內(nèi)仍未找到平臺，則將其置于平臺上并停留10 s，潛伏期記為120 s?？臻g探索實(shí)驗(yàn)在定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束的第2天進(jìn)行，撤除平臺，記錄120 s內(nèi)大鼠在平臺象限的游泳時間和游泳距離百分比。

1.6ChAT和AchE活力的測定 空間探索實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)束后立即處死大鼠，在冰盤上斷頭取腦，將右側(cè)腦組織用冰生理鹽水沖洗，除去血液，濾紙吸干，電子天平稱重。在冰浴下制備10%的腦組織勻漿，用比色法測定各組大鼠腦組織中ChAT、AchE的活力，所有操作嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7免疫組化法檢測大鼠大腦皮質(zhì)和海馬Aβ1～40的表達(dá) 將左側(cè)腦組織置于4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，制成5 μm厚連續(xù)切片，行SABC免疫組化法染色。每只動物取3張切片，每張切片隨機(jī)取互不重疊的5個視野，在高倍鏡下(×400)采用Biomias99圖像分析系統(tǒng)檢測大鼠大腦皮質(zhì)和海馬中Aβ1～40的平均灰度值(MG)。

2 結(jié) 果

2.1DHTL對自然衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 與青年對照組比較，老年模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長(P<0.01)；而在平臺象限的游泳時間和游泳距離百分比均明顯降低(P<0.01)，提示老年模型組大鼠學(xué)習(xí)定位能力顯著下降，存在明顯的學(xué)習(xí)記憶功能障礙，表明老年癡呆大鼠模型成功。使用DHTL灌胃后，各給藥組大鼠逃避潛伏期均明顯縮短；在平臺象限的游泳時間和游泳距離百分比則明顯增加，且DHTL中、高劑量組與老年模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。

2.2DHTL對自然衰老大鼠腦組織中ChAT、AchE活力的影響 老年模型組大鼠腦組織中ChAT活力明顯降低，AchE活力顯著增強(qiáng)，與青年對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與老年模型組相比，DHTL各劑量組均能顯著降低AchE活力(P<0.01)，中、高劑量組還能明顯升高ChAT活力(P<0.01)，且具有一定的量效關(guān)系。見表2。

2.3DHTL對自然衰老大鼠大腦皮質(zhì)和海馬Aβ1～40表達(dá)的影響 免疫組化染色結(jié)果顯示，老年模型組大鼠大腦皮質(zhì)、海馬神經(jīng)元胞質(zhì)呈深染棕黃色顆粒狀改變，MG平均灰度值較青年對照組顯著降低(P<0.01)；與老年模型組比較，DHTL各劑量組大鼠大腦皮質(zhì)、海馬神經(jīng)元胞質(zhì)呈淺染棕黃色顆粒狀改變，MG均有不同程度增加(P<0.01)，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系，結(jié)果見圖1、圖2和表2。

表1 DHTL對自然衰老大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)記憶能力的影響

表2 DHTL對自然衰老大鼠ChAT、AchE活力及Aβ1～40表達(dá)的影響

圖1 丹黃通絡(luò)膠囊對不同組別大鼠海馬神經(jīng)元Aβ1～40表達(dá)的影響(×400)

圖2 丹黃通絡(luò)膠囊對不同組別大鼠大腦皮質(zhì)中Aβ1～40表達(dá)的影響(×400)

3 討 論

AD是發(fā)生于老年前期或老年期的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶功能障礙和行為異?！?，3〕。但是，由于AD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前臨床上使用單一靶點(diǎn)的藥物很難取得滿意療效，而中藥治療疾病具有多靶點(diǎn)的特性，有廣闊的研發(fā)前景。本研究所使用的丹黃通絡(luò)膠囊主要是由丹參、黃芪、銀杏葉等五味中藥組成的復(fù)方制劑，近年來研究表明，丹參制劑及其有效成分能明顯抑制AD模型大鼠大腦組織中β-淀粉樣蛋白(Aβ)的增高，顯著提高ChAT活力，對改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙有較好療效〔4，5〕；黃芪是補(bǔ)氣良藥，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力和提高衰老小鼠抗氧化物酶活性的作用〔6〕；銀杏葉及其提取物能提高中樞膽堿能神經(jīng)功能，增加腦血流量，減少腦組織耗氧量，具有抗血栓、抗氧化等功能〔7，8〕。本研究發(fā)現(xiàn)中、高劑量丹黃通絡(luò)膠囊能明顯縮短大鼠逃避潛伏期，增加其在平臺象限的游泳時間和游泳距離百分比，這表明丹黃通絡(luò)膠囊對自然衰老大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力有一定的改善作用。

中樞膽堿能系統(tǒng)是形成學(xué)習(xí)記憶的主要通路，學(xué)者普遍認(rèn)為老年性癡呆的主要原因是中樞膽堿能系統(tǒng)功能不足，并且其臨床癥狀的嚴(yán)重程度和膽堿能系統(tǒng)的活性密切相關(guān)〔9〕。乙酰膽堿(Ach)是該系統(tǒng)中一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在學(xué)習(xí)記憶信息的傳遞中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。但是由于Ach性質(zhì)極不穩(wěn)定，因此極難準(zhǔn)確測定其含量，而催化其合成的酶ChAT和促進(jìn)其分解的酶AchE，他們的活性變化分別能間接反映Ach在腦中合成率和分解率的改變，二者共同維持著Ach的動態(tài)平衡。本實(shí)驗(yàn)說明丹黃通絡(luò)膠囊對自然衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用可能與恢復(fù)中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能有關(guān)。

由于Aβ在水中溶解度較低，且有很強(qiáng)的自聚性，在適宜條件下，能很快聚集成纖維，就產(chǎn)生了神經(jīng)毒性作用，從而誘發(fā)神經(jīng)元發(fā)生凋亡。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)證實(shí)〔10，11〕，各種原因?qū)е碌闹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)內(nèi)淀粉樣前體蛋白(APP)的過多表達(dá)，以及APP被降解產(chǎn)生過量的Aβ是啟動AD發(fā)病的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丹黃通絡(luò)膠囊各劑量組均能顯著減少Aβ1～40在自然衰老大鼠大腦皮質(zhì)和海馬中的表達(dá)，且具有明顯的量效關(guān)系，這說明丹黃通絡(luò)膠囊對自然衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用可能與降低Aβ沉積有關(guān)，但是關(guān)于其是否能減少神經(jīng)元的凋亡及其主要機(jī)制，尚在進(jìn)一步研究中。

4 參考文獻(xiàn)

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