低灌注處理對家兔心肌缺血再灌注損傷的影響

趙 艷 楊鴻雁 劉興德

(貴陽醫(yī)學院分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

急性心肌梗死后，成功地再灌注缺血心肌是減少心肌梗死面積、改善臨床預后最有效的方法，但同時也會導致附加的缺血/再灌注(I/R)損傷。這種形式造成的損傷可高達最終心肌梗死面積的50%〔1〕，因此I/R損傷的機制及如何減少I/R損傷受到研究者的廣泛關(guān)注。目前I/R損傷的機制仍未完全闡明，但已證明與氧化應(yīng)激、鈣超載、炎癥反應(yīng)、能量代謝障礙、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放、生理PH值的快速恢復有關(guān)。本研究對急性心肌缺血的家兔，在心肌再灌注時給予低灌注處理，探討低灌注處理對I/R家兔心功能的影響，并進一步探討低灌注處理對家兔心肌凋亡基因bcl-2、caspase-3表達的影響。

1 材料與方法

1.1動物與材料 新西蘭大白兔 (體重2.5～3.0 kg) ，雌雄不限，由貴陽醫(yī)學院動物中心購得。Trizol購自Invitrogen，RNAisoTMPlus由大連寶生物公司生產(chǎn)，引物由上海Sangon公司合成，bcl-2一抗采用武漢博士德公司生產(chǎn)的兔多克隆抗體。

1.2家兔心肌I/R模型的制作 自家兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，仰臥固定于實驗臺。手術(shù)分離出右頸總動脈，結(jié)扎遠端，由近端將自制導管插入左心室，并經(jīng)壓力換能器與多項導聯(lián)生理記錄儀連接，氣管插管，連接小型動物呼吸機，呼吸頻率40次/min，潮氣量15 ml/kg。沿胸骨左緣剪斷第3肋骨，暴露心臟，剪開心包，暴露心前血管。從左心耳根部下約3 mm處進針，結(jié)扎線穿過淺層心肌橫跨前室間溝從肺動脈圓錐旁出針，放置松解拉線后結(jié)扎冠脈前降支。結(jié)扎成功標準為心電圖ST段弓背向上抬高，松開結(jié)扎線，提拉松解拉線以恢復冠脈血流，抬高的ST段下降50%以上為再灌注成功。

1.3實驗分組 新西蘭大白兔雌雄不限16只，隨機分為2組各8只，分別給予以下處理：①A組(缺血再灌注組)：結(jié)扎LAD30 min，再灌注180 min ，再灌注時予生理鹽水10 ml靜注5 min；②B組(低灌注處理組)：結(jié)扎LAD 30 min，結(jié)扎前放置一直徑0.7 mm的圓柱形短鋼針，再灌注時先抽去鋼針使低灌注3 min(20%<血流量<50%)〔2，3〕，然后松解結(jié)扎線，同時生理鹽水10 ml靜注5 min，再灌注180 min。

1.4家兔血流動力學的檢測 壓力換能器一端與插入左心室導管連接，另一端與多導生理記錄儀連接，記錄結(jié)扎前、結(jié)扎30 min、再灌注180 min時LVSP、LVEDP和±dp/dtmax的變化。

1.5bcl-2蛋白表達檢測 處死家兔取左室缺血區(qū)心肌，中性甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，免疫組化法檢測bcl-2蛋白表達，心肌細胞質(zhì)中有棕黃色顆粒者為bcl-2陽性細胞。采用高清晰度彩色病理圖像測量系統(tǒng)，在400×視野下，測定平均光密度值作半定量分析。

1.6bcl-2、caspase3 mRNA表達的檢測 實驗終點，家兔以人道方式處死，取左室缺血區(qū)心肌組織，液氮冷凍保存?zhèn)錂z。取缺血區(qū)心肌50 mg，嚴格按操作說明提取總RNA，以O(shè)ligo dt為引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。家兔管家基因GAPDH為內(nèi)參，內(nèi)參及目的基因bcl-2、caspase3引物用primer 5軟件設(shè)計，引物序列見表1。目的基因與內(nèi)參在同一體系中進行PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物進行電泳并對其積分光密度值進行測量，同一泳道上目的基因的積分光密度值與內(nèi)參積分光密度值之比，為該目的基因相對含量。

2 結(jié) 果

2.1低灌注處理對家兔I/R心肌LVSP、LVEDP和±dp/dtmax的影響 與A組比較，B組的左室內(nèi)壓最大收縮/舒張變化速率(±dp/dtmax)增高(P<0.05)，見表2。

2.2低灌注處理對心肌I/R家兔凋亡基因bcl-2 蛋白表達的影響 與A組比較(151.64±12.53)，B組的bcl-2蛋白表達增高(168.37±15.30，P<0.05) ，見圖1。

2.3低灌注處理對心肌I/R家兔凋亡基因bcl-2、caspase-3 mRNA表達的影響 與A組比較，B組的bcl-2 mRNA表達增高(0.81±0.017 vs 0.72±0.021)(P<0.05)，而caspase-3 mRNA表達降低(0.53±0.027 vs 0.62±0.034，P<0.05)， 見圖2，圖3。

表1 引物序列

表2 低灌注處理對家兔I/R心肌LVSP、LVEDP和±dp/dtmax的影響

圖1 兩組心肌組織bcl-2蛋白表達(DAB，×400)

圖2 家兔心肌I/R bcl-2 mRNA表達

圖3 家兔心肌I/R caspase-3 mRNA表達電泳圖

3 討 論

眾多基礎(chǔ)及臨床研究證實缺血預處理、缺血后處理對I/R損傷有保護作用。研究發(fā)現(xiàn)缺血后處理可以縮小心肌梗死面積，具有心臟保護作用〔4〕，隨后缺血后處理的心肌保護作用在多種動物得到證實。

逐步開通受阻血管為一種改良后處理。范謙等〔5〕在犬I/R模型中經(jīng)漸處理即逐步恢復冠狀動脈血流，50% 2 min、80% 2 min之后再灌注3 h，結(jié)果顯示與I/R組進行比較，缺血后處理和漸處理均促進再灌注后心功能的恢復，降低再灌注后心律失常的發(fā)生，并降低再灌注后血清心肌酶活性，兩者差異無統(tǒng)計學意義。漸處理作為一種改良的后處理方式，由于不附加額外的缺血，可能有更廣闊的臨床應(yīng)用前景。Musiolik等〔6〕在豬I/R模型中運用指數(shù)演算公式，緩慢的增加冠脈回流量超過基線30 min后形成溫和再灌注，和直接再灌注組比較，溫和再灌注組可縮小心肌梗死面積，但不是通過再灌注損傷的補救激酶(RISK) 途徑。Hattori等〔7〕在I/R模型中采用階段灌注即在開始再灌注的前10 min冠脈血流量維持在閉塞前的20%，然后逐漸釋放，再灌注開始20 min后釋放完。與直接再灌注組比階段再灌注組在減少冠脈血流量和減少梗死面積方面無明顯差別，但在冠狀動脈血流儲備方面有保護作用。Akcora等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)逐步開通受阻血管可提高組織中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶含量，減低氧化應(yīng)激，減小I/R損傷。在此類研究中，無論是在分幾步開通、逐步開通時的血流控制及逐步開通所用時間上，研究者逐步開通受阻血管的方法相差很大。

本研究中的低灌注處理為分兩步再灌，低灌注處理時間參照缺血后處理定為3 min，低灌注時流量參照兔冬眠心肌模型制作，理論上控制在﹤50%〔2，3〕。本文提示低灌注處理對I/R損傷心肌有保護作用，可能機制是通過上調(diào)抑凋亡基因、下調(diào)凋亡基因的表達降低細胞凋亡率，減小心肌梗死面積，從而對I/R損傷心肌有保護作用。

4 參考文獻

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4Zhao ZQ，Corvera JS，Halkos ME,etal.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion：comparison with ischemic preconditioning〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003;285：H579-88.

5范 謙,楊新春,王樹巖,等.“漸處理”降低了犬心肌缺血再灌注/損傷〔J〕.中華心血管病雜志,2006;34(4):363-6.

6Musiolik J,van Caster P,Skys Chally A,etal.Reduction of infarct size by gentle reperfusion without activation of reperfusion injury salvage kinases in pigs〔J〕.Cardiovasc Res,2010;85 (1)：110-7.

7Hattori R,Matsui H,Kitano M,etal.Staged reperfusion preserves the coronary flow reserve，especially in the regions not severely damaged by ischemic injury in the canine heart〔J〕.Angiology,1998;49(12):991-1004.

8Akcora B，Altug ME，Balci A,etal.Gradual detorsion of torsioned rat testis attenuatesischemia reperfusion injury〔J〕.J Pediatr Surg,2008;43(10):1879-84.