糖尿病大鼠微循環(huán)與坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡的相關(guān)性及中藥復(fù)方的干預(yù)

李 光 張文風(fēng) 蘇 鑫 粟 栗

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117)

糖尿病(DM)周圍神經(jīng)病變(DPN)是DM的慢性并發(fā)癥之一，隨著病程的延長，發(fā)病率可達(dá)90%以上〔1〕。DPN的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前缺乏安全有效的治療方法及藥物。以往研究表明，以益氣活血通絡(luò)為治法的中藥復(fù)方能夠改善DM大鼠血液流變學(xué)，提高坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度，調(diào)節(jié)血清胰島素、C肽的分泌，降低糖化血清蛋白及坐骨神經(jīng)人糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)含量〔2～5〕。在前期研究的基礎(chǔ)上，繼續(xù)探究DM大鼠微循環(huán)與其坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡的相關(guān)性及中藥干預(yù)作用，旨在揭示其防治機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑及藥品 鏈脲佐菌素(STZ)：美國SIGMA公司。中藥復(fù)方由黃芪、桂枝、生地、水蛭組成，由本校制劑室提供。彌可?！残l(wèi)材(中國)藥業(yè)公司生產(chǎn)〕，全自動(dòng)血液流變快測儀FASCO-3010(重慶大學(xué)維多生物工程研究所)，TNNUL細(xì)胞凋亡試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)，病理切片機(jī)(德國Leica公司)，光學(xué)顯微鏡及成像系統(tǒng)(日本Olympus公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?選用8周齡雄性健康Wistar大鼠，體重220～250 g。適應(yīng)性飼喂1 w后，禁食12 h，將STZ臨用前用0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液(pH 4.2、4℃)配成2%濃度溶液，按劑量50 mg/kg左下腹腔內(nèi)單次注射，72 h后取尾血側(cè)血糖，凡血糖≥16.7 mmol/L作為DM大鼠。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后將DM大鼠隨機(jī)分為三組，即模型組、中藥組、彌可保組，每組10只。并取體重、鼠齡相匹配的同批正常大鼠 10只，用0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液(pH 4.2、4℃)左下腹腔內(nèi)單次注射，72 h后取尾血測血糖，血糖值在正常范圍內(nèi)的大鼠作為正常對照組。大鼠實(shí)驗(yàn)期間按組分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，飼喂大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料 。連續(xù)觀察8 w。

1.3體重、血糖檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前稱其體重。取尾靜脈血測其血糖。

1.4血液流變學(xué)檢測 大鼠麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，肝素抗凝，應(yīng)用全自動(dòng)血液流變快測儀FASCO-3010測定。

1.5TNNUL檢測細(xì)胞凋亡 將大鼠腹腔注射20%烏拉坦(5 ml/kg)進(jìn)行麻醉然后將其俯臥固定于固定架上，剖開雙側(cè)股骨皮膚，暴露出坐骨神經(jīng)，用無菌剝離器小心剝離坐骨神經(jīng)后取出，置于10%甲醛液中，標(biāo)本按常規(guī)固定、脫水，石蠟包埋，切片(厚5 μm)備用。TNNUL法檢測細(xì)胞凋亡。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠體重、血糖變化的比較 與正常對照組相比，模型組、中藥組、彌可保組動(dòng)物的體重明顯減輕，血糖明顯升高(均P<0.05)；在血糖的調(diào)節(jié)上，中藥組與模型組及彌可保組相比差異顯著。見表1。

表1 各組大鼠體重、血糖變化的比較

2.2各組大鼠血液流變學(xué)變化的比較 與正常對照組相比，模型組、中藥組、彌可保組大鼠全血度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)及剛性指數(shù)明顯升高(均P<0.05)；與模型組相比，中藥組具有顯著差異，而彌可保組無顯著差異。與彌可保組相比，中藥組具有顯著性差異。見表2。

2.3TNNUL法細(xì)胞凋亡檢測的比較 與正常對照組(4.5±0.7)相比，模型組、中藥組、彌可保組大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)(51.6±8.2，39.5±6.8，23.6±4.5)明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，中藥組、彌可保組具有顯著差異(P<0.05)。與彌可保組比較，中藥組有顯著差異(P<0.05)。

表2 各組大鼠血液流變學(xué)變化的比較

3 討 論

中醫(yī)認(rèn)為，DPN是由于DM日久，氣陰兩虛、瘀血阻絡(luò)所致。益氣活血通絡(luò)法方由黃芪、桂枝、生地、水蛭組成。具有養(yǎng)陰益氣、活血化瘀之功。已經(jīng)公認(rèn)，血液循環(huán)張障礙所導(dǎo)致的神經(jīng)組織缺血缺氧是DPN主要的發(fā)病原因之一〔6〕。改善微循環(huán)對增加周圍神經(jīng)的供血和營養(yǎng)、抑制坐骨神經(jīng)的纖維脫髓鞘和軸索萎縮、提高傳導(dǎo)速度〔7，8〕有重要作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，對于DM大鼠的體重、血糖、血液流變學(xué)、坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡的改善益氣活血通絡(luò)方藥均優(yōu)于彌可保，可能由于彌可保治療僅針對DNP發(fā)病的單一因素，而中藥復(fù)方能起到整體調(diào)節(jié)作用，充分發(fā)揮中醫(yī)多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)，辨證論治的優(yōu)勢和特色有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，血液流變性改變，微循環(huán)障礙，神經(jīng)組織缺血缺氧，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡，證實(shí)了二者的相關(guān)性。益氣活血通絡(luò)方藥改善微循環(huán)，對坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用，為其對DM坐骨神經(jīng)損傷的保護(hù)機(jī)制提供一定線索，其確切的作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

1梁曉春，郭賽珊.治療糖尿病神經(jīng)病變的思路與方法〔J〕.中醫(yī)雜志，1999；40(1)：52-3.

2張文風(fēng)、蘇 鑫，趙書鋒.益氣活血通絡(luò)法防治糖尿病周圍神經(jīng)病變的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中醫(yī)藥信息，2008；25(6)：73-4.

3張文風(fēng).益氣活血通絡(luò)方對糖尿病大鼠血清胰島素、C肽的影響.湖南中醫(yī)雜志，2008；24(5)：98-9.

4張文風(fēng)，蘇 鑫，粟 栗.糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)AGEs的表達(dá)及益氣活血通絡(luò)方的干預(yù)研究〔J〕.上海中醫(yī)藥雜志，2010；44(3)：69-71.

5張文風(fēng)，蘇 鑫，粟 栗.從血液流變學(xué)和神經(jīng)傳導(dǎo)速度評價(jià)益氣活血通絡(luò)法對糖尿病周圍神經(jīng)病變的干預(yù)作用〔J〕.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010；21(2)：439-40.

6衡先培，張發(fā)榮.Advances in treatment of diabetic neuropathy by traditional Chinese medicine〔J〕.JTCM,1998；18(2):146-52.

7張一娜，璀 璨，張亞清，等.老年心腦血管疾病、糖尿病血液流變學(xué)改變〔J〕.中國微循環(huán)雜志，2002；6(3):167-8.

8張文風(fēng).九蟲丹對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠血液流變學(xué)影響的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中醫(yī)藥信息，2004；21(5)：32-3.