全身振動(dòng)對(duì)去卵巢大鼠骨組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)的影響

司會(huì)群 卜淑敏 趙俊勇 文思敏 段曉麗

(首都體育學(xué)院，北京 100191)

骨質(zhì)疏松多發(fā)生于絕經(jīng)后女性和老年男性〔1，2〕。雌激素替代療法是臨床治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的常用方法，在一定程度上能緩解骨質(zhì)疏松癥狀，但也會(huì)給身體其他系統(tǒng)帶來(lái)不良反應(yīng)，出現(xiàn)不可耐受的副作用。國(guó)內(nèi)外已有很多關(guān)于非藥物療法預(yù)防及治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的研究。國(guó)外學(xué)者研究已證實(shí)，全身振動(dòng)刺激可防治婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松〔3〕,但機(jī)制還不清楚。雖然研究表明血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)作為最有效的促血管生長(zhǎng)因子參與骨形成和骨吸收過(guò)程〔4，5〕，但全身振動(dòng)刺激在治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松過(guò)程中是否影響骨組織VEGF蛋白的表達(dá)，目前筆者查閱文獻(xiàn)還未見(jiàn)報(bào)道。鑒此，本研究采用全身振動(dòng)干預(yù)手段，觀察全身垂直振動(dòng)刺激對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織VEGF蛋白表達(dá)的影響，旨在為探討絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松振動(dòng)療法的作用機(jī)制提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 36只3月齡健康雌性未孕SD大鼠，體重(260±12)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并飼養(yǎng)〔動(dòng)物合格證號(hào)SCXK (京)2006-0008〕，標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料，自由飲水和進(jìn)食，使用3R實(shí)驗(yàn)動(dòng)物原則給予人道關(guān)懷。

1.2動(dòng)物手術(shù)與分組 大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1 w后，按體重隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham,12只)，去卵巢組(24只)。各組大鼠在手術(shù)前均禁食12～18 h，腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉,去卵巢組從背部切除雙側(cè)卵巢,假手術(shù)組只切除卵巢旁與卵巢等大的一塊脂肪組織。無(wú)菌手術(shù)在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部進(jìn)行。術(shù)后自由飲水進(jìn)食,1 w后按體重將去卵巢組大鼠隨機(jī)分為去卵巢靜止組(OVX,12只)和去卵巢振動(dòng)組(WBV,12只)。在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過(guò)程中，2只DVX組大鼠因腹部粘連而死亡，最后納入實(shí)驗(yàn)的各組大鼠數(shù)目分別為：假手術(shù)組12只，OVX組10只，WBV組12只。

1.3全身振動(dòng)方案 手術(shù)后第10周，用XR-36型雙能X線骨密度儀(DEXA)檢測(cè)去卵巢兩組大鼠的腰椎骨密度，確定骨密度已經(jīng)下降后，WBV組大鼠先在振動(dòng)臺(tái)上適應(yīng)性振動(dòng)訓(xùn)練1 w，1次/d，15 min/次,振動(dòng)加速度為3.8 g，頻率為90 Hz，7次/w。從第11周開(kāi)始進(jìn)行正式全身振動(dòng)，2次/d，振動(dòng)頻率和加速度不變。所有振動(dòng)實(shí)驗(yàn)均在上午進(jìn)行，正式振動(dòng)處理時(shí)間為7 w。

1.4全身骨密度檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，按腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉大鼠，麻醉后將大鼠俯臥在DEXA測(cè)量平臺(tái)上，在小動(dòng)物模式下掃描各大鼠全身和主要部位骨密度。

1.5骨標(biāo)本的采集 各組大鼠取材前均禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉后腹主動(dòng)脈取血處死。根據(jù)大鼠解剖位置截取第3腰椎、股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端并剝離干凈，液氮凍存，用以提取總蛋白。

1.6Western 印跡檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)水平 將骨組織在液氮中迅速研磨成粉末，取200 g粉末加入1 ml含PMSF的組織裂解液靜置于冰上2 h，4℃，12 000 r/min離心30 min。取上清液與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)按照4∶1混合，沸水浴5 min后即刻放置在冰上冷卻，分裝后-40℃保存。取15 μl蛋白樣品上樣，在10%SDS-Page凝膠中電泳。電泳結(jié)束后，在80 V電壓下轉(zhuǎn)膜2 h，然后在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉液中封閉2 h，加一抗(Mouse-抗-VEGF;Rabbit-抗-β-actin,)4℃過(guò)夜；次日，將膜用TBST洗3次，10 min/次，加入TBST稀釋的二抗(馬抗小鼠IgG/磷酸酶標(biāo)記和山羊抗兔IgG/磷酸酶標(biāo)記)室溫孵育2 h；TBST洗膜3次，10 min/次；用BCIP/NBT化學(xué)顯色至出現(xiàn)條帶，蒸餾水終止顯色，拍照，用Quatity One軟件掃描各條帶灰度值后進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠在體骨密度的比較 OVX組大鼠第5腰椎、股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端骨密度顯著低于sham組大鼠(P<0.01或P<0.001)，而全身骨密度無(wú)顯著性差異(P>0.05)；WBV組大鼠脛骨近端骨密度顯著高于OVX組(P<0.01)，而其他部位骨密度無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠在體骨密度的比較

2.2各組大鼠骨組織VEGF蛋白表達(dá)的比較 與Sham組比較，OVX組脛骨近端骨組織VEGF蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01)，而股骨遠(yuǎn)端和腰椎無(wú)顯著性差異(P>0.05)；與OVX組比較，WBV組腰椎、股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端VEGF蛋白表達(dá)均顯著增加(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)圖1。

與Sham組比較：1)P<0.05;與OVX組比較：2)P<0.05;3)P<0.01

3 討論

近幾年來(lái)，運(yùn)用物理療法來(lái)防治骨質(zhì)疏松已成為研究熱點(diǎn)〔6，7〕。機(jī)械強(qiáng)度低于引起骨組織損傷的振動(dòng)信號(hào)不僅可以防止骨丟失，還能改善骨結(jié)構(gòu)，具有很強(qiáng)的促進(jìn)骨形成的效應(yīng)，是一種具有應(yīng)用前景的治療骨質(zhì)疏松的物理療法〔8〕。

前期實(shí)驗(yàn)顯示，大鼠的腰椎和股骨松質(zhì)骨骨密度在去卵巢8 w時(shí)會(huì)顯著降低〔9〕。本實(shí)驗(yàn)表明骨質(zhì)疏松模型建立成功。并且全身振動(dòng)能部位依賴性地改善去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度。Judex等〔10〕的研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致。Rubinacci等〔12〕報(bào)道振動(dòng)對(duì)脛骨和脊柱骨密度影響不同可能是因?yàn)槊劰呛图怪写萍に厥荏w分配不同引起。與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果類似，即振動(dòng)刺激對(duì)脛骨骨密度的影響顯著大于對(duì)腰椎骨密度的影響，可能是振動(dòng)刺激明顯增加了脛骨中雌激素受體的數(shù)量，從而顯著增加了骨密度。

VEGF作為體內(nèi)最強(qiáng)的血管內(nèi)皮生成因子，一方面通過(guò)血管化參與骨代謝，另一方面，VEGF還直接參與成骨和破骨作用，已被看作為一種骨代謝調(diào)節(jié)因子〔12，13〕。破骨細(xì)胞的骨吸收和成骨細(xì)胞的骨形成間的偶聯(lián)促使骨量轉(zhuǎn)換處于動(dòng)態(tài)變化中，血管的生成在此耦聯(lián)機(jī)制中起著關(guān)鍵作用〔14〕。Ichiro〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，大鼠去勢(shì)后VEGF的表達(dá)減少，其結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，結(jié)果提示，振動(dòng)刺激可能是通過(guò)促進(jìn)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織VEGF蛋白的表達(dá)而刺激成骨細(xì)胞形成進(jìn)而促進(jìn)骨的重建。李鵬彪〔15〕研究發(fā)現(xiàn)，雌激素可促進(jìn)成骨細(xì)胞VEGF的表達(dá)，潘晉平〔16〕研究也發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度雌激素能促進(jìn)成骨細(xì)胞VEGF的表達(dá)，說(shuō)明VEGF是雌激素調(diào)節(jié)骨代謝的機(jī)制之一。至于振動(dòng)是否通過(guò)雌激素促進(jìn)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織VEGF蛋白的表達(dá)還有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

4 參考文獻(xiàn)

1China health promotion foundation white paper on osteoporosis in China〔J〕.Chin Health Manage,2009;3 (3): 148-54.

2Nochowitz B,Siegert S,Wasik M.An update on osteoporosis 〔J〕.Am J Ther,2009;16(5): 437-45.

3Verschueren SM,Roelants M,Delecluse C，etal.Effect of 6-month whole body vibration training on hip density,muscle strength,and postural control in postmenopausal women: a randomized controlled pilot study〔J〕.Bone Miner Res,2004;19(3):352-9.

4Kohno S,Kaku M,Kawata T,etal.Neutralizing effects of an anti-vaacular endothelial growth factor antibody on tooth movement〔J〕.Angle Orthod,2005；75(5):797-804.

5Zhang Q,Guo R.VEGF-C,a lymphatic growth factor,is a RANKL target an autocrine mechanism 〔J〕.J Biol Chem,2008;283:13491-9.

6陳建庭，鄧軒賡，馮 鷹，等.復(fù)合振動(dòng)治療卵巢切除大鼠骨質(zhì)疏松的初步試驗(yàn)研究〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2008；28(9)：842-4.

7Rubinacci AM，Arenzanz M，Cavani F,etal.Ovariectcmy sensitizes rat cortical bone to while-body vibration〔J〕.Calcif Tissue Int,2008;82(4):316-26.

8Jordan J.Good vibrations and strong bones〔J〕.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2005;288(3):R555-6.

9Bitto A， Altavilla D，Bonaiuto A,etal.Effects of aglycone genistein in a rat experimental model of postmenopausal metabolic syndrome〔J〕.J Endocrinol,2009;200(3):367-76.

10Judex S,Lei X,Han D，etal.Low- magnitude mechanical signal that stimulate bone formation in the ovariectomized rat are dependent on the applied frequency but not on the stain magnitude〔J〕.Biomech,2007;40:1333-9.

11Rubinacci A,Marenzana M,Cavani F，etal.Ovariectomy sensitizes rat cortical bone to whole-body vibration〔J〕.Calcif Tissue Int,2008;82: 316-26.

12Ichiro K,Shumpei N,Mitsuhiro S,etal.Estrogen regulates the prodiction of VEGF for osteoclast formation and activity in op/op mice〔J〕.Joumal of Bone and Mineral Research,2004;2: 200.

13Maes C,Carmeliet P,Moermans K,etal.Impaired angiogenesis and endochondral bone formation in mice lacking the vascular endothelial growth factor isoforms VEGF164 and VEGF188〔J〕.Mech Dev,2002;111(1-2):61-73.

14Cai DJ,Zhao Y,Glasier J,etal.Comparative effect of soy protein,soy isoflavones,and 17β-estradiol on bone metabolism in adult ovariectomized rats 〔J〕.Bone Miner Res,2005;20: 828-39.

15李鵬彪,尹蕓生等.雌激素對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨折愈合過(guò)程成骨細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)藥物與臨床，2010；10(8):321-3.

16潘晉平.雌激素對(duì)成骨細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響〔D〕.山西醫(yī)科大學(xué)，2010:3.