吉林省“公農(nóng)1號”紫花苜蓿高效根瘤菌株的篩選

石茂玲，鄧 波，劉 蒙，徐安凱，王志峰，周 可，周冀瓊

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院草地研究所，北京 100193；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧分院草地研究所，吉林 長春 136100)

紫花苜蓿(Medicagosativa)為多年生豆科牧草，是世界上種植廣泛的優(yōu)質(zhì)牧草，在我國已有2000年的栽培歷史[1]，素有“牧草之王”的美稱。

根瘤菌是一類廣泛分布于土壤中的革蘭氏陰性細菌[2]。根瘤菌能侵染豆科植物根部或莖部形成根瘤或莖瘤，并在根瘤或莖瘤中分化成類菌體，將空氣中的氮素固定為植物可吸收利用的氮[3,4]。根瘤菌與豆科植物形成的共生固氮體系具有非常顯著的特點，要使苜蓿獲得最佳固氮效果，需要根瘤菌與寄主植物間的交互作用匹配很好[5]，而且根瘤菌-豆科植物共生關(guān)系和地理環(huán)境存在密切關(guān)系[6-8]。

吉林省是我國紫花苜蓿的重要生產(chǎn)基地，試驗以栽培面積較大的“公農(nóng)1號”紫花苜蓿為研究對象，對4個生態(tài)類型地區(qū)的紫花苜蓿根瘤菌資源進行調(diào)查，分離純化不同生態(tài)類型地區(qū)的具有優(yōu)良性能的“公農(nóng)1號”苜蓿根瘤菌株，以期為該地區(qū)菌劑研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 根瘤菌資源調(diào)查

試驗選取吉林省4個不同生態(tài)類型地區(qū)，即西部沙地草原區(qū)(白城市)、中部草甸草原區(qū)(大安市)、中部平原農(nóng)田區(qū)(公主嶺市)、東部山地農(nóng)田區(qū)(延吉市)為調(diào)查樣區(qū)。于2011年5月采樣，詳細記錄樣地周圍環(huán)境，土壤類型，植物生長狀態(tài)(營養(yǎng)生長、花期等)以及根瘤形態(tài)。每個樣區(qū)選3個采樣點，每個采樣點3次重復(fù)。采集按照邊長為30 cm的正方形挖掘植株，記錄根瘤數(shù)、有效根瘤數(shù)(粉紅色或淺紅色根瘤)、根瘤著生部位，量取根瘤大小，稱量單個根瘤重及總根瘤重。

1.2 根瘤菌株的分離、純化

將根瘤用無菌水沖洗干凈，0.1%的HgCl2溶液浸泡5 min，95%乙醇處理30～60 s，無菌水沖凈,接種于YMA 斜面,挑取單菌落,革蘭氏染色鏡檢,直至得到純菌落。

1.3 水培回接試驗

回接試驗是確定根瘤分離物是否為根瘤菌的方法，在根部結(jié)瘤的可以初步確定為根瘤菌[9,10]。將“公農(nóng)1號”苜蓿種子消毒催芽后,浸泡于相應(yīng)的根瘤菌株懸液30 min，移入低氮培養(yǎng)基試管，剩余菌液加入微氮培養(yǎng)基試管，加蓋棉塞，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)8～10 d，去掉棉塞，自然培養(yǎng)。每個試管3粒種子，每菌株4個試管作為重復(fù)。同時以不接種根瘤菌株的苜蓿苗為對照，適時加入無菌水。植物生長45 d進行收獲，觀察植株生長并記錄。

1.4 盆栽試驗

1.4.1 土壤處理 試驗在吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧分院溫室進行，土壤類型為暗棕色沙壤土，中性至微酸性。將土壤壓碎去雜，充分混勻，稱取5 kg，121 ℃高溫滅菌后于25 cm花盆種植。

1.4.2 盆栽試驗設(shè)計 將“公農(nóng)1號”苜蓿種子消毒催芽后，用菌液浸泡15 min均勻播種于花盆，播種深度為1.5～2.0 cm，每個花盆栽植10株，并將剩余菌液澆于種苗周圍，同時以不接菌者為空白對照。采用完全隨機試驗設(shè)計，每個處理設(shè)4個重復(fù)。最后轉(zhuǎn)入光強7 000 lx、溫度為( 22±3) ℃、日照時數(shù)12 h的溫室中培養(yǎng)，并根據(jù)花盆中失水狀況定期澆水。

1.4.3 接種效果的觀測 植物生長到61 d開始觀測，收獲時將根沖洗干凈,分別測定每株植物的莖長、根長、根瘤數(shù)和植物干重等。

(1)莖長和根長 將植株完全挖出土壤，用水沖洗根系，在新鮮狀態(tài)下用直尺分別測定主莖和主根的長度。

(2)單株根瘤數(shù) 挖掘植株，輕抖根系的土壤，保證根瘤的完整，用水仔細沖洗后計算單株根瘤數(shù)。

(3)單株干重 將植株在烘箱中120 ℃殺青40 min，70 ℃烘干48 h，稱重。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理 用EXCEL 2007軟件、SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析和處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 根瘤菌資源調(diào)查

吉林省“公農(nóng)1號”紫花苜蓿根瘤菌的調(diào)查共采集了公主嶺農(nóng)田、白城沙地和草地、大安草甸草地、延吉山地農(nóng)田的74株苜蓿，4種生態(tài)類型區(qū)的土壤中苜蓿根瘤多分布于根部10 cm以下的須根上；種植年限較長的苜蓿，根瘤多分布于表層須根；根瘤顏色以紅色、粉紅色或褐紅色居多，形狀大多為橢圓形、指狀、掌狀，部分不規(guī)則。

不同生態(tài)類型地區(qū)、不同土壤類型及不同建植年限“公農(nóng)1號”苜蓿的根瘤數(shù)和根瘤重均存在差異(表1)。2010年種植于白城地區(qū)鹽堿土的根瘤重顯著大于沙壤土(P<0.05)，但鹽堿地苜蓿根瘤數(shù)與沙壤土根瘤數(shù)間差異不顯著；沙壤土中根瘤重相差不顯著的情況下，2003年種植的苜蓿的根瘤數(shù)明顯比2008、2010年的根瘤數(shù)多。大安地區(qū)草原草甸土中，2003和2010年苜蓿的根瘤數(shù)相差不多，但2003年苜蓿的根瘤重顯著大于2010年苜蓿的根瘤重(P<0.05)。于1997年種植于延吉地區(qū)的苜蓿，山地暗棕壤的根瘤數(shù)和根瘤重顯著多于農(nóng)田灰棕壤，農(nóng)田灰棕壤顯著多于山溝暗棕壤(P<0.05)。公主嶺沙壤土1989年種植的苜蓿的根瘤重顯著大于其他年份苜蓿的根瘤重，但根瘤數(shù)最少；2006年苜蓿的根瘤數(shù)顯著高于其他年份苜蓿的根瘤數(shù)(P<0.05)，同時其根瘤重較大。

表1 不同生態(tài)類型地區(qū)根瘤分布，根瘤數(shù)和根瘤重

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 根瘤菌分離、純化與回接

從采集的根瘤中，通過分離獲得純培養(yǎng)物81株，均為快生菌。分離純化的菌株在回接試驗中，有8個菌株能使“公農(nóng)1號”苜蓿結(jié)瘤。綜合結(jié)瘤數(shù)、生物量、根瘤重等指標，通過對菌株的顯微形態(tài)、生理生化的研究，初步確定這8菌株為根瘤菌株，并用于盆栽篩選試驗(表2)。

表2 篩選出的根瘤菌株編號及來源

2.3 接種根瘤菌株對苜蓿生長和結(jié)瘤的影響

經(jīng)過75 d溫室盆栽試驗，所得根瘤大多數(shù)是橢圓形、指狀，極少數(shù)為掌狀(表3)。

2.3.1 根瘤菌株對紫花苜蓿生長的影響 通過分析了接種根瘤菌株的“公農(nóng)1號”苜蓿的莖長、根長、葉片數(shù)、干重和根瘤數(shù)數(shù)據(jù)，可以看出，根瘤菌株對苜蓿的莖長、根長、葉片數(shù)、干重和根瘤數(shù)均有明顯影響，在8個供試菌株中，對莖長影響較顯著的菌株依次是yj34、bc94、gzl59、yj30、bc18和bc8，分別使莖長增加60.17%、59.86%、52.38%、51.83%、45.60%和39.75%，bc10和da80與其他菌株間差異顯著(P<0.05)。8菌株均對植株根長有顯著影響，使根長增加29.68%～64.32%，其中，接種gzl59的效果最好，比對照增加64.32%；供試菌對植株葉片數(shù)的影響也很顯著，菌株bc94、yj34、yj30、gzl59和bc18的葉片數(shù)顯著高于其他菌株(P<0.05)；供試苜蓿接種根瘤菌株gzl59、bc94、bc18、yj30和yj34能顯著增加其單株干重(P<0.05)，其中接種gzl59效果最好，比對照增長約3倍。

2.3.2 根瘤菌株對紫花苜蓿結(jié)瘤的影響 單株根瘤數(shù)不僅包括已具有固氮能力的根瘤和暫時還不具有固氮能力的根瘤，同時還包括沒有固氮能力的無效瘤?！肮r(nóng)1號”接種的所有根瘤菌株與對照差異顯著(P<0.05)，根瘤數(shù)比對照增加32%～104%。菌株bc8、bc10、bc18、yj30、yj34及菌株gzl59的結(jié)瘤效果較好，其中菌株yj34根瘤數(shù)最多(P<0.05)。

表3 接種不同根瘤菌株后苜蓿莖長、根長、葉片數(shù)、干重和根瘤數(shù)

3 討論與結(jié)論

(1)植物本身的遺傳特性以及外界生境的不同會使根瘤的生成及其在宿主植物上的著生部位、顏色、形狀等基本形態(tài)特征存在一定差異[11,12]。生長在不同生境的紫花苜蓿，根瘤分布情況不同，這與趙龍飛[13]，徐琳等[14]的研究結(jié)果類似。

研究報道，土著菌數(shù)量的多少與土壤肥力、水分、當?shù)貧夂驐l件等有關(guān)。楊旭升等[15]研究表明，種植苜蓿對土壤中苜蓿根瘤菌數(shù)量的明顯增加具有時間的累加效應(yīng)。種植3年乃至多年的草甸土或鹽堿土苜蓿根瘤菌的含量明顯多于僅種植1年的草地土壤。且不同的土壤中土著菌的生存和定殖能力不同。土著菌的數(shù)量多少還與土壤的質(zhì)地有關(guān)，與質(zhì)地較差的土壤相比，質(zhì)地較好的土壤可以為根瘤菌提供更多的保護，因此，根瘤菌的數(shù)量也較多[16,17]。此外，復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境可能比單一的生態(tài)環(huán)境更利于根瘤菌的生存和結(jié)瘤。

結(jié)果表明，吉林省域內(nèi)同一地區(qū)同一土壤類型的苜蓿種植時間越長，其根瘤重量越大；同年種植的苜蓿，鹽堿土的根瘤重大于沙壤土，山地暗棕壤的根瘤數(shù)多于農(nóng)田灰棕壤。說明不同生態(tài)類型地區(qū)、不同土壤類型及不同建植年限的根瘤數(shù)量、重量存在差異。根瘤形成和發(fā)育與生態(tài)類型、土壤環(huán)境和建植年限存在著密切相關(guān)。此次試驗與其他研究者的研究結(jié)果一致，可為吉林省根瘤菌資源研究及其開發(fā)利用提供相關(guān)科學(xué)資料。

(2)諸多研究發(fā)現(xiàn)，生態(tài)條件、土壤類型及起源等都會影響豆科植物與根瘤菌共生作用及其有效性[18,19]。師尚禮等[20]在2001年做的苜蓿根瘤菌有效性及影響因子的研究也表明，土壤結(jié)構(gòu)、類型等會對土壤中根瘤菌的數(shù)目及其有效性產(chǎn)生影響。寧國贊等[21]、戴小密等[22]研究發(fā)現(xiàn)，根瘤菌接種在各地區(qū)增產(chǎn)幅度差異較大。黃芳等[23]也發(fā)現(xiàn)，同一豆科植物與根瘤菌組合在不同土壤中的產(chǎn)量差異顯著。王晶等[24]在黑土和草甸土上接種根瘤菌株，發(fā)現(xiàn)由于中性或微堿性環(huán)境適于根瘤菌生長，根瘤菌在黑土上的接種效果極顯著高于草甸土。

采用“公農(nóng)1號”苜?；亟咏Y(jié)瘤試驗，從分離純化的81株根瘤分離物中獲得匹配性較好的8個菌株。再經(jīng)篩選，獲得促進植株生長、結(jié)瘤能力均較強的根瘤菌株bc94，gzl59和yj34，確定為“公農(nóng)1號”苜蓿吉林省區(qū)域內(nèi)的高效根瘤菌株。3個高效菌株接種苜蓿的生長效應(yīng)優(yōu)于其他菌株，說明來源于沙壤土、暗棕壤和山溝生態(tài)類型地區(qū)“公農(nóng)1號”苜蓿的根瘤菌株表現(xiàn)優(yōu)于來源于其他土壤類型或生態(tài)類型地區(qū)根瘤菌株，對苜蓿植株具有促進作用。同時說明了根瘤菌對生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)性。

(3)土壤盆栽試驗，對照處理(無接種)的苜蓿也出 現(xiàn)了結(jié)瘤現(xiàn)象，說明“公農(nóng)1號”苜蓿種子中有內(nèi)生的根瘤菌存在。雖然其存在有助于苜蓿結(jié)瘤固氮和植株生長，但從試驗各處理的結(jié)果和對照的顯著性分析來看，在結(jié)瘤競爭能力方面，種子內(nèi)的根瘤菌遠不如所接種的根瘤菌。這與陳力玉等[25]的研究結(jié)果一致。

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