苜蓿耐藥根瘤菌篩選及熒光蛋白標記對根瘤菌耐藥性的影響

霍平慧，師尚禮，苗陽陽

(甘肅農業(yè)大學 草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅 蘭州 730070)

與自然存在的土著根瘤菌比，人工選育的根瘤菌常具有固氮效率高、促生效果好等優(yōu)勢。但釋放到田間的目標根瘤菌，需要與環(huán)境中的土著根瘤菌以及其他影響目標菌結瘤的雜菌在營養(yǎng)、空間及宿主等方面進行競爭[1]。我國西北內陸土壤相對貧瘠的現(xiàn)狀使得豆科牧草的根瘤菌接種效率低下[2]。目前多采用篩選抗性菌株的方法提高菌種適應性，以增加其在不同環(huán)境中的競爭能力。此外，所篩選的高效根瘤菌一旦投入生產，制成商業(yè)化產品根瘤菌劑后，還面臨著貯藏期間因空氣中雜菌入侵所導致的高污染率問題[3,4]。因此，常通過向菌劑中添加抑菌劑的措施降低菌劑污染率并增加其施用到田間后的競爭結瘤能力[5,6]。

對有關3種稀土鹽抑菌劑La(NO3)3·6H2O，LaCl3和Ce(NO3)3·6H2O及2種植物源抑菌劑苦參堿，除蟲菊素的研究發(fā)現(xiàn)[7,8]，上述抑菌劑均對空氣和土壤源雜菌有較好的抑制效果。在此基礎上明確所篩選根瘤菌對以上所說抑菌劑的耐受程度，對于制備高競爭型抗污染根瘤菌劑至關重要，同時也是后續(xù)菌劑制備工作進行的基礎。有效選擇對空氣及土壤源雜菌抑制效果好、而對根瘤菌的選擇毒性低的抑菌劑類型，可降低所制備菌劑的污染率并增加目的菌株施用到田間后的競爭效果。此外，針對根瘤菌研究中占瘤率測定難的現(xiàn)狀，以研究方法檢測靈敏度高、對試驗材料無能源負擔為基本原則[9]，對所篩選根瘤菌進行青色熒光蛋白(cfp)標記，并測定標記根瘤菌對抑菌劑的耐受性變化，以達到能夠更加簡單的識別目標根瘤菌，并降低后續(xù)工作的強度和技術成本的目的，以期為后期所接種根瘤菌回接效果以及所制備菌劑抗污染效果的測定提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植物材料 2012年6月，于甘肅農業(yè)大學蘭州牧草試驗站選取6個苜蓿品種。各苜蓿品種的根瘤分別取自多于3處栽培地的生長健壯、無病蟲害、根瘤數(shù)多且顏色粉紅的苜蓿植株。

1.1.2 供試抑菌劑材料 稀土鹽抑菌劑La(NO3)3·6H2O,LaCl3和Ce(NO3)3·6H2O，購自五礦(北京)稀土研究院有限公司，為常規(guī)農用稀土，具有抗炎、殺菌等藥理活性。

表1 苜蓿品種及來源

植物源抑菌劑，苦參堿和除蟲菊素，購自寶雞方晟生物開發(fā)有限公司，均為植物源殺蟲劑?？鄥A主要以其生物堿成分發(fā)揮抑菌作用，對昆蟲、病原菌的毒力較強，對人畜的選擇毒性低；除蟲菊素屬神經毒劑，主要起觸殺作用，對高等動物低毒，見光后可緩慢分解為水和CO，環(huán)保無公害。

1.2 根瘤菌的分離與鑒定

1.2.1 苜蓿根瘤的分離與處理 將各品種苜蓿植株根系挖出后，以自來水淋洗根系表面附著的土壤和有機質，取下根系上顏色偏紅和偏粉紅的根瘤，置于無菌三角瓶中，加醫(yī)用碘伏溶液震蕩滅菌2 min后，以無菌水沖洗，重復上述過程3次。最后用無菌濾紙吸干根瘤表面水分待用。

根瘤表面處理藥劑，醫(yī)用碘伏消毒液(聚乙烯吡咯烷酮碘)，稀釋一倍后有效碘濃度為2 500 mg/L。將表面滅菌處理苜蓿根瘤置于無菌研缽中，加入5 mL無菌水，充分研磨后，將組織勻漿轉入5 mL無菌離心管中，于4 000 r/min離心10 min，取上清液，并依次用無菌水配制10-3、10-4、10-5稀釋液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 根瘤菌的篩選鑒定 將各品種苜蓿根瘤研磨上清液及稀釋液均勻涂抹于無氮固體培養(yǎng)基，28 ℃下恒溫培養(yǎng)6～7 d后選取各平板中的單菌落進行菌株分離。將分離的固氮菌株分別劃線接種于含有剛果紅和結晶紫的YMA固體培養(yǎng)基上，28 ℃下恒溫培養(yǎng)，48 h后挑選每培養(yǎng)皿中不吸附色素并符合根瘤菌形態(tài)特征的典型菌株進行劃線分離純化[10]，待菌落直徑長至最大時，測量并記錄各菌株菌落形態(tài)(直徑、外觀、粘稠度)。

溴麝香草酚蘭(BTB)反應 向YMA基本培養(yǎng)基中添加終濃度為0.5%的溴麝香草酚藍的乙醇溶液。將菌株接種于含BTB的平板，培養(yǎng)48 h后，觀察菌落周圍培養(yǎng)基顏色的變化情況。

3-酮基乳糖反應 將各菌株點接于添加乳糖的YMA平板中,以不添加乳糖的平板為對照,培養(yǎng)48 h后向皿中菌落滴加本尼迪試劑(Benedict) 覆蓋菌苔。菌落周圍出現(xiàn)黃褐色沉淀者為陽性反應,未出現(xiàn)黃褐色沉淀者為陰性反應。

接觸酶反應 將供試菌株點接于YMA培養(yǎng)基上,待菌苔長出后,滴加3%的H2O2溶液并立即檢查結果，5 min內出現(xiàn)氣泡者為陽性反應，未出現(xiàn)氣泡則為陰性反應[11]。

碳源利用類型 以YMA固體培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基，并分別用淀粉、乳糖、檸檬酸、蔗糖、果糖和葡萄糖作為唯一碳源，測定各菌株的碳源利用特性。

革蘭氏染色反應 對上述過程中有待進一步篩選的初篩菌株進行革蘭氏染色，將所有制備好的染色載波片置于蔡司熒光倒置顯微鏡下觀察染色后的菌株顏色及形態(tài)特征。

上述試驗中，所有測定菌株均設3個陽性重復和1個陰性對照，并對各品種苜蓿根瘤中生化特性符合的篩選菌株進行編號保存，作為符合根瘤菌基本特征的初篩菌株。以購自中國農業(yè)科學院微生物保藏中心的中華苜蓿根瘤菌S.12531 (Sinorhizobiummeliloti/Ensifermeliloti) 為對照菌株，以實驗室保存的R.GN5 (RzhizobiumGN5) 根瘤菌株作為參比菌株。

1.3 含抑菌劑平板的制備及初篩根瘤菌的抑菌劑抗性測試

1.3.1 含抑菌劑平板的制備 以YMA固體培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，制備La(NO3)3·6H2O,LaCl3和Ce(NO3)3·6H2O，這3種稀土鹽離子的終濃度為200、400、600、800和1 000 mg/L的含藥平板，以及含有300、400、500、600和700 mg/L苦參堿和500、1 000、1 500和2 000 mg/L除蟲菊素的含藥平板，每處理3次重復。

1.3.2 初篩根瘤菌株的抑菌劑抗性測試 將各品種編號保存的初篩根瘤菌點接于含藥平板，以購自中國農業(yè)科學院微生物保藏中心的中華苜蓿根瘤菌S.12531為對照菌株，以實驗室保存的R.GN5(RzhizobiumGN5) 根瘤菌株為參比菌株，測定各篩選根瘤菌的抑菌劑抗性。

將1.3.2中對高濃度抑菌劑耐受性較好的根瘤菌株送往中國農業(yè)科學院微生物研究所菌種保藏中心進行生化指標鑒定并測定16sRNA序列。得到1株編號為LH3436的苜蓿根瘤菌(343-6)，為對0.6 mg/mL苦參堿具有耐受性的根瘤菌株。

1.4 熒光標記根瘤菌的構建

1.4.1 供試菌株活化 供體菌株E.colipMP 4517，含有cfp(青色熒光蛋白)，營養(yǎng)缺陷型菌株，無法在SM培養(yǎng)基上生長，對慶大霉素有抗性(Gmr)；

輔助菌株E.colipRK2073，營養(yǎng)缺陷型菌株，無法在SM培養(yǎng)基上生長，對壯觀霉素有抗性(Sper)；

受體菌株1S.12531，標準菌，購自中國農業(yè)科學院微生物保藏中心；

受體菌株2R.GN5，實驗室保存的苜蓿根瘤菌；

受體菌株3R.LH3436，1.3.2中篩選出的對苦參堿抑菌劑具有優(yōu)良抗性的苜蓿根瘤菌。

抗生素平板制備，將0.22 μm濾膜過濾滅菌的高濃度Gm和Spe母液于TY/LB/SM固體培養(yǎng)基冷卻至40 ℃加入，使其終濃度分別為40 μg/mL和20 μg/mL。

1.4.2 受體菌感受態(tài)菌株制備 受體菌于28 ℃下YMA固體培養(yǎng)基中活化24 h，轉入YMA液體培養(yǎng)基，同一溫度下振蕩培養(yǎng)3～4 h，待菌液D600 nm達到0.4時[12]，置于冰上輕輕搖動預冷，15 min后將冷卻菌液轉入預冷的50 mL離心管，4 ℃下3 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入15 mL預冷的0.1 mol/L的無菌CaCl2溶液，并輕搖使細胞重新懸浮，置于冰上20～30 min后再次于4 ℃下3 000 r/min離心5 min。棄上清液，加入2 mL冰上預冷的0.1 mol/L的CaCl2溶液，輕搖后用于轉化或低溫冷藏備用。

1.4.3 cfp熒光標記根瘤菌的構建 分別在添加40 μg/mL Gm和20 μg/mL Spe的LB平板上劃線活化供體菌4 517和輔助菌2 073，在TY平板上活化受體菌。而后用接種針分別挑取少量活化供體菌株和輔助菌株至添加40 μg/mL Gm和20 μg/mL Spe的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)至對數(shù)生長期(D600 nm= 0.3～0.5)，挑取少量活化受體菌株至TY液體培養(yǎng)基中，28 ℃下培養(yǎng)至對數(shù)生長期(D600 nm=0.5～0.8)。

將活化的供體菌、輔助菌和受體菌(感受態(tài)細胞)按1∶1∶1體積比混合，8 000 r/min 離心5 min，得到沉淀混合菌體，加1 mL TY液體培養(yǎng)基并用力搖勻后重復離心，留沉淀，重復2次，而后用200 μL的槍頭不斷抽吸沉淀菌體，得到打散的濃菌液。

在無菌狀態(tài)下將濃菌液轉移至貼于TY固體培養(yǎng)基表面的無菌濾膜上，3片/皿，28 ℃下正置培養(yǎng)，待菌液中的液體被平板吸收后，改為倒置培養(yǎng)，2～3 d后將皿中濾膜轉移至添加5 mL無菌水的西林瓶中，在漩渦振蕩器上充分打散菌體，取其10倍稀釋液0.2 mL涂抹于SM和SM+Gm固體培養(yǎng)基，28 ℃下恒溫培養(yǎng)7 d，SM+Gm平板上新長出的菌落即為具有Gm抗性的受體菌接合子。為進一步確定所篩選出的接合子為熒光標記根瘤菌，可將所有接合子分別對應點接于TY和無N固體培養(yǎng)基上，綜合每一接合子在2種培養(yǎng)基上的生長情況，將在TY培養(yǎng)基上發(fā)黃綠色熒光并能在無N培養(yǎng)基上正常生長的接合子確定為熒光標記根瘤菌[13]。

1.4.4 標記根瘤菌株的抑菌劑耐受性變化檢測 參考1.3.1的方法制備不同濃度的含抑菌劑平板，將制備好的熒光標記菌S.12531f，R.GN5f和R.LH3436f分別點接于各平板，觀察其抑菌劑耐受性的變化情況。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS16.0以SNK法進行數(shù)據(jù)分析和差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 根瘤菌的分離過程

6個品種紫花苜蓿的根瘤中均含有大量根瘤菌。經過形態(tài)鑒定、革蘭氏染色、剛果紅色素吸附情況以及在無氮培養(yǎng)基上的生長情況等初步鑒定手段，以各品種根瘤中初篩菌株在無氮培養(yǎng)基上的生長速度和活力狀況為主要依據(jù)，在6個品種的紫花苜蓿中共篩選出39株固氮效果好、菌種活力高的初篩菌株(表2)。各品種紫花苜蓿根瘤中固氮效果優(yōu)良的初篩菌株比例相同，其中，WL343HQ和甘農3號2個品種中高固氮活力的菌株較多，為每個品種8株，以Qingshui較少，為5株外，其他3個品種均為6株。

表2 初篩根瘤菌株編號及寄主植株

2.2 初篩根瘤菌株的形態(tài)學鑒定、生理生化特性測試及抑菌劑耐受性

將初篩菌株劃線接種于YMA剛果紅培養(yǎng)基上，36 h觀察平板中單菌落形態(tài)，進行根瘤菌的初步篩選。發(fā)現(xiàn)在39株初篩菌株中，各菌株菌落直徑為4.5～6.0 mm，其中，直徑集中在5.0和5.5 mm處。各初篩菌株均為含有粘質胞外多糖且不吸附色素的白色半透明菌落，其形態(tài)呈平坦凸起或半球形凸起，邊緣光滑，基本符合伯杰氏菌種鑒定手冊中對根瘤菌形態(tài)的定義，可以確定為根瘤菌初篩菌株。

所有初篩39株根瘤菌株為快生型產酸菌，培養(yǎng)36 h時，各菌株單菌落直徑即達到4 mm以上[14]，同時均為革蘭氏陰性菌，均不能利用檸檬酸鹽，且在過氧化氫酶測試中都表現(xiàn)出陽性反應，試驗測試結果符合根瘤菌的生化代謝特征[15]，但所有的初篩菌株及參比菌株均可利用淀粉，這不符合根瘤菌的生理生化特性(表3)。在39株初篩的根瘤菌中，多數(shù)菌株難以利用D-果糖，但大多數(shù)可以利用乳糖。除Q-3、Q-4和Q-5不能利用葡萄糖，可以基本排除其為根瘤菌的可能性外，其他菌株均可利用葡萄糖；絕大多數(shù)菌株在3-酮基乳糖反應中都表現(xiàn)為陰性反應，而343-2、343-4、Q-1、G5-1、G5-5、G3-3、G3-5和G3-6為陽性，也可以排除為根瘤菌株的可能性。

表3 初篩根瘤菌株的主要生理生化特性

注：“+”表示菌株能夠生長或呈陽性反應，“-”表示菌株不能生長或呈陰性反應

將所有39株初篩根瘤菌及對照菌株和參比菌株點接于含有不同濃度梯度及類型抑菌劑的平板中，進行培養(yǎng)，觀察其生長狀況，發(fā)現(xiàn)所有點接菌株均可耐受0.4 mg/mL及以下濃度的苦參堿抑菌劑，以及所有類型的0.2 mg/mL的La3+抑菌劑，并且均可耐受試驗濃度范圍內的除蟲菊素抑菌劑(表4)。La(NO3)3·6H2O濃度達到0.4 mg/mL時，所有點接菌株均無法長出，而在同一濃度下添加CeNO3·6H2O和LaCl3的平板中，有少量點接菌長出，La3+濃度為0.6 mg/mL時，所有點接根瘤菌均無法長出，說明La(NO3)3·6H2O對根瘤菌的抑制效果較CeNO3·6H2O和LaCl3強。在含有0.4 mg/mL苦參堿抑菌劑的平板中，仍有少量點接菌長出，部分優(yōu)秀菌株甚至可耐受0.6 mg/mL的苦參堿抑菌劑。將表4中對某一抑菌劑耐受性較好的菌株送檢，進行進一步生理生化指標的鑒定，得到LH3436菌株，為可耐受0.6 mg/mL苦參堿抑菌劑的根瘤菌。

表4 初篩根瘤菌株對各類型及濃度抑菌劑的抗性

注：“+”表示各菌株可以在平板上生長，“-”表示各菌株無法在平板上生長。下同

2.3 熒光標記根瘤菌株的抑菌劑耐受性變化

將對照菌株S.12531，參比菌株R.GN5和篩選根瘤菌R.LH3436構建熒光標記根瘤菌后，經過熒光活性的遺傳穩(wěn)定性測試，選取熒光活性穩(wěn)定，發(fā)光強度大的各標記菌株，參照表3，4點接于含有不同濃度及類型抑菌劑的平板上，進行培養(yǎng)并觀察熒光標記對根瘤菌抑菌劑耐受性的影響(表5)。結果與表3，4比較無變化，說明熒光標記并未影響根瘤菌的抑菌劑耐受性。

表5 熒光標記根瘤菌的抑菌劑耐受性

3 討論與結論

研究發(fā)現(xiàn)，在根瘤菌的篩選過程中，各初篩菌株在對剛果紅吸附狀況、BTB反應、接觸酶反應、革蘭氏染色等的生理生化反應以及對檸檬酸鹽和蔗糖等碳源的利用情況表現(xiàn)完全一致，符合根瘤菌的代謝特征，但所有初篩菌株可利用可溶性淀粉，不符合根瘤菌的代謝特征，是由環(huán)境影響所致。區(qū)域環(huán)境因素的改變，在影響了宿主植株生長的同時也改變了根瘤菌的存活環(huán)境，造成根瘤菌種群和數(shù)量的變化，進而導致根瘤菌表型和遺傳型多樣性的改變。這與趙佚麗等[16]對臺灣相思根瘤菌的研究結果一致，即在特定環(huán)境下，根瘤菌的生理生化特性表現(xiàn)出多樣性。所有初篩根瘤菌株在3-酮基乳糖反應以及葡萄糖、果糖和乳糖等碳源利用試驗中表現(xiàn)出差異性，少數(shù)菌株可在上述指標中排除為根瘤菌的可能性。相比較而言，各初篩菌株在無氮培養(yǎng)基上的生長速度及菌落直徑指標最能反映各菌株的活力狀況，該過程排除根瘤菌可能性的初篩菌株數(shù)目最多。

與各類型及濃度梯度抑菌劑對空氣和土壤中雜菌的抑制效果相比[7,8]，所有初篩根瘤菌株對植物源類抑菌劑的相對耐受效果好，而對稀土鹽類抑菌劑的耐受效果差，表明植物源類抑菌劑對試驗初篩根瘤菌的選擇毒性低，這與環(huán)境條件所導致的根瘤菌生理生化特性的一致性有關[17]，即根瘤菌株的抗逆性因其所在地區(qū)環(huán)境的差異而存在差異性[18]。同時，所有初篩菌株對抑菌劑的耐受性均類似或優(yōu)于對照和參比菌株。一方面可能與初篩菌株剛分離自田間植株根瘤，在實驗室中繼代培養(yǎng)的次數(shù)較少，菌株活力維持的較好有關；另一方面則是由于將所有初篩菌株點接于含抑菌劑平板中，接種量大，促進了菌株耐受性的增強。

將熒光標記的R.LH3436，S.12531和R.GN5根瘤菌點接于含各濃度梯度及類型抑菌劑的平板中，并觀察其生長狀況，發(fā)現(xiàn)所有標記菌的耐受性與原始菌株比無變化。表明熒光蛋白標記技術在將發(fā)光基因導入根瘤菌的同時，并未對目標根瘤菌造成額外負擔，這符合理想的菌株標記方法，即檢測靈敏度高、方法簡單、成本低廉且標記基因對標記菌不產生負擔，可在宿主細胞中穩(wěn)定保存等。張淑卿等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，氯化鑭作為外源物質時，對熒光標記根瘤菌的生長有一定的促進作用。而陳力玉等[20]在關于熒光標記根瘤菌和出發(fā)菌株對寄主植株回接效果的測試中也發(fā)現(xiàn)，進行了熒光標記的根瘤菌對寄主植株的促生效果與原始菌株比無差異，這與試驗的研究結果類似，即熒光標記根瘤菌的構建并不影響原始菌株本身的性質，不影響菌株回接對寄主植株的促生效果或是菌株本身的抑菌劑耐受性，表明使用三親本雜交法構建熒光標記根瘤菌可以當做一種簡單且檢測靈敏度高的方法用于菌劑耐受性及回接后植株促生效果的測試。

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