人羊水特異蛋白質(zhì)組學(xué)的探討研究

朱斌 陳芳 侯常 黎麗紅 黃素華

羊水對(duì)于胎兒的正常發(fā)育至關(guān)重要，其生成量和成分與胎兒的發(fā)育、胎盤(pán)和羊膜腔的功能密切相關(guān)[1］。羊水中蛋白質(zhì)組學(xué)研究亦成為近年研究熱點(diǎn)。本研究初步觀察了在羊水中特異表達(dá)的蛋白質(zhì)及高表達(dá)的蛋白質(zhì)，旨在為妊娠相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)病機(jī)制的探索研究提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

一、試劑及儀器

1.試 劑

主要有：ProteoPrep Blue Albumin and IgG Depletion Kit血清高豐度蛋白去除試劑盒、四甲乙二胺（Sigma，美國(guó)），固相化pH 4～7、24 cm梯度干膠條、Bradford染液（Bio-Rad，美國(guó)），丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris、甘氨酸十二烷基磺酸鈉（SDS）、尿素、CHAPs、過(guò)硫酸銨、碘乙酰氨、二硫蘇糖醇（Amersham Pharmacia Biotech，瑞典），一氯乙腈（成都貝斯特）。

2.儀 器

包括：IPGphor3等電聚焦儀、EttanDALT垂直電泳槽、Image scanner掃描儀、超聲儀（GE，美國(guó)），Autoflex speed？MALDI-TOF質(zhì)譜儀（Bruker Dalton，美國(guó)），冷凍離心機(jī)（中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠）等。

二、蛋白樣品的制備

選擇3名正常妊娠晚期（37周）孕婦，征得其知情同意后，以羊膜穿刺法采集3份羊水標(biāo)本，每份5 ml，同時(shí)以肘部穿刺取靜脈血標(biāo)本3份，每份5 ml。所采集的標(biāo)本分別在4℃、16 000×g離心15 min，取上清，0.4μm過(guò)濾后分裝， -70℃保存。離心超濾濃縮樣品，ProteoPrep Blue Albumin and IgG Depletion Kit試劑盒去除血清高豐度蛋白質(zhì)，加入4倍體積丙酮，-20℃沉淀過(guò)夜。沉淀所得到的蛋白于4℃、12 000×g離心20 min，棄上清，晾干，-80℃凍存?zhèn)溆谩Ｓ肂radford法定量蛋白質(zhì)濃度。

三、雙向凝膠電泳及圖像分析

將去除高豐度蛋白的蛋白團(tuán)塊重溶。24 cm干膠條在含100μg蛋白質(zhì)樣本和水化液的460μl混合液中20℃水化10～12 h。將膠條放入等電聚焦盤(pán)中加電壓聚焦。第一向等電聚焦電泳 （IEF）后，待膠條平衡，再進(jìn)行12%的聚丙烯電泳酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，電泳所得的雙向凝膠用雙胺硝酸銀法染色及考馬斯亮藍(lán)染色，Imagescanner掃描儀進(jìn)行透射掃描，獲得的數(shù)字化圖像運(yùn)用ImageMaster 2D platinum 5.0軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢測(cè)、量化、背景扣除、點(diǎn)的匹配。著重選擇pH4～7，分子量10～55 KDa區(qū)域進(jìn)行觀察，從羊水中找到僅在羊水中表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)及在羊水中表達(dá)量高于血清2倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)，隨機(jī)選取重復(fù)性和分辨率較高的10個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)行基質(zhì)輔助激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜 （MALDI-TOF/TOFMS）鑒定。

四、MALDI-TOF/TOF-MS分析

選取行MALDI-TOF/TOF-MS分析的蛋白質(zhì)點(diǎn)后行挖點(diǎn)、脫色、還原、烷基化、酶解、樣品回收及脫鹽處理、肽段提取后點(diǎn)靶上機(jī)，使用Autoflex speedTMMALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。利用flexAnalysis軟件過(guò)濾基線峰、識(shí)別信號(hào)峰。利用Mascot軟件搜索NCBI及Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)，尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)，同時(shí)查詢其功能，明確鑒定的蛋白質(zhì)為何種蛋白質(zhì)。

結(jié) 果

一、高豐度蛋白去除后雙向凝膠電泳分析結(jié)果

在pH 4～7、分子量10～55 KDa的區(qū)域中，羊水及血清的蛋白質(zhì)位點(diǎn)分布大部分相同，血清組的斑點(diǎn)多于羊水組（見(jiàn)圖1A、B）。經(jīng)ImageMaster 2D platinum 5.0軟件分析，羊水中約有（613±29）個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，血清中約有（785±64）個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，羊水中特異表達(dá)的蛋白點(diǎn)約50個(gè)（見(jiàn)圖1C），羊水中表達(dá)量高的蛋白點(diǎn)約50個(gè)（見(jiàn)圖1D）。

圖1 去除高豐度蛋白后的雙向凝膠電泳分析結(jié)果

二、MALDI-TOF/TOF-MS分析結(jié)果

隨機(jī)選取重復(fù)性和分辨率較高的10個(gè)濃度差異的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)行質(zhì)譜分析鑒定，質(zhì)譜分析結(jié)果見(jiàn)圖2及表1。

討 論

羊水作為胎兒生長(zhǎng)發(fā)育最為重要的因素之一，在多種妊娠疾病的發(fā)生中有重要作用。蛋白質(zhì)組學(xué)是繼人類(lèi)基因組計(jì)劃完成后的新興學(xué)科[2］。隨著人類(lèi)蛋白質(zhì)組學(xué)組織（HUPO）的正式成立，蛋白質(zhì)組學(xué)蓬勃發(fā)展，滲透到各個(gè)學(xué)科。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外均有學(xué)者對(duì)妊娠婦女血液、羊水進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，探索新的妊娠蛋白和疾病特異蛋白，以及蛋白質(zhì)在妊娠相關(guān)疾病發(fā)生、發(fā)展中的相互作用。然而，目前的多數(shù)研究集中于尋找羊水中特異性的差異蛋白，筆者前期經(jīng)nano LC/MS/MS對(duì)羊水的蛋白組學(xué)分析，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)羊水中人62種特異性蛋白[3］。本次通過(guò)比較Anderson等[4］和Michel等[5］的結(jié)果，新檢測(cè)到了22種僅在AF中表達(dá)的蛋白，其中14種是分泌型蛋白，其余8種分布于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。羊水特異性蛋白斑點(diǎn)約50余個(gè)，與此前nano LC/MS/MS的結(jié)果相符，故本研究不行此類(lèi)斑點(diǎn)的質(zhì)譜分析。

圖2 3種在羊水和血清中呈濃度差異表達(dá)的蛋白質(zhì)

表1 10個(gè)在羊水及血清中呈濃度差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)質(zhì)譜分析結(jié)果

本研究初步探討在羊水和血清中均有表達(dá)，但羊水中表達(dá)量明顯要高于血清的一些蛋白質(zhì)。研究初步挑選其中10個(gè)重復(fù)性和分辨率較高斑點(diǎn)行質(zhì)譜鑒定，檢索UniProt等在線蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，除2個(gè)斑點(diǎn)為細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)蛋白外，余均為分泌型蛋白質(zhì)。這些蛋白的已知功能如下：硫酸類(lèi)肝素蛋白多糖（HSPG2）是基底膜的主要成分，對(duì)心臟發(fā)育及血管調(diào)節(jié)起著重要作用，此類(lèi)蛋白質(zhì)缺乏可導(dǎo)致常染色體隱性遺傳病侏儒綜合征的發(fā)生[6］。絨毛膜生成激素（CSH1）具有刺激泌乳、促進(jìn)胎兒生長(zhǎng)及新陳代謝等作用[7］。載脂蛋白AI為雙超螺旋模型的溶液結(jié)構(gòu)B鏈，參與膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)，使其從組織中轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟。因其影響膽固醇代謝，在HDL缺乏癥及淀粉樣變中起著重要的作用，其缺乏可引起早發(fā)冠心病，肝、脾腫大，復(fù)發(fā)性周?chē)窠?jīng)病變，進(jìn)行性肌肉萎縮和無(wú)力，其突變可致淀粉樣多神經(jīng)病腎病、家族性淀粉樣多神經(jīng)病[8-9］。AMBP蛋白是α1微球蛋白前體，具有抑制胰蛋白酶、纖溶酶、粒細(xì)胞前溶酶體酶及草酸鈣結(jié)晶的作用[10］。另外，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白（IGFBP）具有延長(zhǎng)胰島素樣生長(zhǎng)因子的半衰期，調(diào)節(jié)IGF的促進(jìn)生長(zhǎng)作用[11］。載脂蛋白E與胎兒生長(zhǎng)有一定關(guān)系[8］。硫氧還原蛋白過(guò)氧化物酶2（PRDX2），與細(xì)胞氧化還原調(diào)節(jié)有關(guān)，在清除新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化物起著重要的作用，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的濃度，誘使生長(zhǎng)因子和TNF-α的信息傳導(dǎo)[12］。BPIFA1蛋白與接觸刺激物后引起的氣道炎癥有一定的關(guān)聯(lián)，與上呼吸道的天然免疫有一定關(guān)系。亦在腫瘤的演化進(jìn)展起著一定的作用[13］。補(bǔ)體因子B是補(bǔ)體系統(tǒng)的替代途徑，被D因子激活成2個(gè)片段Ba、Bb，Bb結(jié)合3b因子產(chǎn)生C3或C5轉(zhuǎn)化酶，對(duì)B細(xì)胞的增殖及分化起著一定作用，Ba的作用與此相反，與溶血性尿毒綜合征非典型4（AHUS4）有關(guān)[14］。羊水的某些蛋白質(zhì)表達(dá)可反映妊娠生理或病理狀態(tài)，可能有助于妊娠相關(guān)疾病如胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限、子癇前期、早產(chǎn)、宮內(nèi)感染甚至羊水栓塞等的早期診斷。本研究中在羊水表達(dá)水平偏高的蛋白質(zhì)是否可提供某種診斷依據(jù)還待進(jìn)一步研究證明。此外，鑒于本研究?jī)H采用質(zhì)譜蛋白鑒定策略，今后將對(duì)羊水中呈差異表達(dá)的蛋白質(zhì)采用免疫印跡或其他的方法行進(jìn)一步驗(yàn)證，以確定其是完整的蛋白還是片段蛋白。

[1]劉振江，袁正偉，趙群，等.神經(jīng)管缺陷胎兒和神經(jīng)管缺陷胎鼠羊水蛋白質(zhì)標(biāo)記的比較研究.中華小兒外科雜志，2009，30：777-781.

[2]邱宗蔭.臨床蛋白質(zhì)組學(xué).北京：科學(xué)出版社.2008：2-3.

[3]季煜華，曾耀英，周堅(jiān)，等.應(yīng)用nanoLC/Ms/MS對(duì)人羊水的蛋白質(zhì)組學(xué)分析.暨南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版，2008，29：99-104.

[4]Anderson NL，Polanski M，Pieper P，et al.The human plasma proteome：a nonredundant list dcvdoped by combination of four separate sources.Mol Cell Proteomics，2004，3：311-326.

[5］Michel PE，Crettaz D，Morier P，et a1.Proteome analysis of human plasma and amniotic fluid by Off-Gel isoelectric focusing followed by nano-LC-MS/MS.Electrophoresis，2006，27：1169-1181.

[6]Smith S，Hassell JR.Focus on molecules：perlecan（HSPG2）.Exp Eye Res，2006，83：471-472.

[7］Pérez-Ibave DC，Rodríguez-Sánchez IP，Garza-Rodríguez MD，et al.Extrapituitary growth hormone synthesis in humans.Growth Horm IGF Res，2014，14：19-27.

[8]郭永和，昝朝霞，張維君.冠狀動(dòng)脈病變程度與血脂成分異常相關(guān)性分析.中國(guó)循環(huán)雜志，2009，24：101-104.

[9]Delpech M，Valleix S.Amyloid polyneuropathies-biochemical and genetic aspects.Bull Acad Natl Med，2012，196：1309-1318.

[10]Zhang Y，Gao Z，Guo Z，et al.The crystal structure of human proteinα1M reveals a chromophore-binding site and two putative protein-protein interfaces.Biochem Biophys Res Commun，2013，439：346-350.

[11]陸學(xué)萍，陸志浩，錢(qián)麗娟，等.孕婦血清IGF-1、IGF-2、IGFBP-3水平與正常胎兒生長(zhǎng)的相關(guān)性.復(fù)旦學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)科學(xué)版，2012，39：616-620.

[12]Nagababu E，Mohanty JG，F(xiàn)riedman JS，et al.Role of peroxiredoxin-2 in protecting RBCs from hydrogen peroxide-induced oxidative stress.Free Radic Res，2013，47（3）：164-171.

[13]Liu Y，Bartlett JA，Di ME，et al.SPLUNC1/BPIFA1？contributes to pulmonary host defense against Klebsiella pneumoniae respiratory infection.Am J Pathol，2013，182：1519-1531.

[14]Slade C，Bosco J，Unglik G，et al.Deficiency in？complement factor B.N Engl JMed，2013，369：1667-1669.