條件啟動(dòng)子pCTR4在隱球菌基因表達(dá)調(diào)控中的應(yīng)用

趙靜宇 法振宗 方偉 孟云芳 張超 周兆婧 潘煒華 廖萬(wàn)清

(上海長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所全軍真菌病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚科，上海 200003)

新生隱球菌(Cryptococcus neoformans)是臨床上最常見(jiàn)的侵襲性真菌感染病原菌之一，可感染免疫功能抑制和免疫功能正常的宿主，主要引發(fā)具有致命威脅的腦膜腦炎。近年來(lái)，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，僅在HIV 感染人群中每年全球約有1 000 000例新發(fā)病例，對(duì)人民健康造成了極大的危害［1］。

隨著隱球菌多個(gè)致病菌株的全基因組測(cè)序工作的完成，其生物學(xué)與致病機(jī)制研究已邁入了一個(gè)全新的研究階段。鑒于其明確的遺傳學(xué)背景、健全的分子生物學(xué)工具以及強(qiáng)健的動(dòng)物模型，隱球菌已漸漸發(fā)展成為病原真菌分子致病機(jī)制研究的模式酵母［2］。條件誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)是病原真菌功能基因組學(xué)研究的重要分子生物學(xué)工具，對(duì)于鑒定致死性關(guān)鍵基因、研究基因表達(dá)水平與功能效應(yīng)關(guān)系必不可少。目前，國(guó)外同行在半乳糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子pGAL7、交配誘導(dǎo)啟動(dòng)子pMFα1以及銅離子抑制啟動(dòng)子pCTR4研究方面取得了重要的研究進(jìn)展［3-5］。以此為基礎(chǔ)，我們通過(guò)重建條件啟動(dòng)子pCTR4質(zhì)粒，應(yīng)用同源重組方法成功對(duì)隱球菌泛素編碼基因UBI 1實(shí)現(xiàn)了條件誘導(dǎo)性調(diào)控表達(dá)，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)隱球菌基因調(diào)控研究領(lǐng)域的空白，并為相關(guān)基因的后續(xù)功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌株與質(zhì)粒 新生隱球菌格魯比變種標(biāo)準(zhǔn)株H99(VN I型)由美國(guó)John Perfect教授惠贈(zèng)提供，受體菌大腸桿菌Top10為本實(shí)驗(yàn)室保存，重建株ZJY01、ZJY02、 ZJY03 (CTR 4(p)-UBI 1::NEO)為本文中新構(gòu)建。質(zhì)粒pJAF-1(含NEO抗性基因)、pNAT/CTR4-2(含銅離子抑制性啟動(dòng)子pCTR4)均由美國(guó) John Perfect教授惠贈(zèng)［6-7］。

培養(yǎng)基與主要試劑 基礎(chǔ)培養(yǎng)基為YPD(隱球菌)和LB(大腸桿菌)，以此為基礎(chǔ)分別添加遺傳霉素G418 200 mg/L、羧芐青霉素100 mg/L作為篩選培養(yǎng)基。山梨醇、硫酸銅、溴烷銨CTAB、浴酮靈二磺酸BCS等主要試劑均購(gòu)自Sigma-aldrich公司，rTaq、PrimeSTAR 等DNA 聚合酶、DNA ladder等PCR相關(guān)試劑購(gòu)自Takara公司。凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、酵母基因組和RNA抽提試劑盒、TA克隆試劑盒、cDNA合成和Real Time PCR試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

主要儀器 電泳凝膠成像系統(tǒng)、Eppendorf超速離心機(jī)、BioRad基因槍、BioRad PCR儀、分光光度計(jì)等。

1.2 條件啟動(dòng)子重組片段及其質(zhì)粒的構(gòu)建

套疊PCR構(gòu)建NEO/CTR4重組片段 第1輪PCR，以質(zhì)粒pJAF-1為模板，引物1、2合成抗性基因NEO片段;以質(zhì)粒pNAT/CTR4為模板，引物3、4合成銅離子抑制性啟動(dòng)子pCTR4片段。第2輪PCR，以上兩個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化后的基因片段(相同摩爾濃度)為模板，引物1、4合成并擴(kuò)增基因片段NEO/CTR4重組片段(見(jiàn)圖1)。所有引物均由Prime3軟件設(shè)計(jì)完成，信息詳見(jiàn)表1。

表1 引物列表Tab.1 Primers list

構(gòu)建重組質(zhì)粒pNEO/CTR4 將上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳后的目標(biāo)條帶以凝膠回收試劑盒割膠純化回收，分光光度計(jì)測(cè)量回收后DNA的濃度。將純化后的基因片段NEO/CTR4經(jīng)rTaq酶處理添加"A"尾后，經(jīng)T-A克隆進(jìn)入pMD18-T載體 (T-A克隆試劑盒)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pNEO/CTR4。取重組質(zhì)粒10 μL加入至100 μL大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Top10，冰浴30 min后42℃熱激45 s，再次冰浴5 min后加入LB培養(yǎng)基890 μL，置入37℃搖床孵育2 h(180 r/min);后以3 000 r/min離心5 min棄上清并加入200 μL新鮮LB液體，懸浮混勻后涂板LA(LB+羧芐青霉素100 mg/L)，置入37℃培養(yǎng)箱孵育16 h。

重組質(zhì)粒驗(yàn)證 挑取LA固體培養(yǎng)基上16個(gè)單克隆子，應(yīng)用引物3、4行煮菌PCR。挑取煮菌篩選正確的單克隆，接種于新鮮LA培養(yǎng)基中，抽提質(zhì)粒定量，并行測(cè)序驗(yàn)證(由上海美吉生物技術(shù)有限公司完成)。

1.3 條件啟動(dòng)子在隱球菌基因表達(dá)調(diào)控中的應(yīng)用及驗(yàn)證

套疊PCR合成基因啟動(dòng)子同源重組框 第一輪PCR，首先應(yīng)用CTAB方法抽提獲得隱球菌的基因組 DNA［6］，以之為模板，應(yīng)用引物 5、6 合成目的基因上游同源重組片段 (5-Franking Region，5-FR即目的基因啟動(dòng)子所在區(qū)域)，應(yīng)用目的基因下游同源重組片段 (3-Franking Region，3-FR即目的基因編碼區(qū));以新建質(zhì)粒pNEO-CTR4為模板，引物1、4合成NEO/CTR4 DNA片段。第二輪PCR:以上述3個(gè)產(chǎn)物純化后的等摩爾濃度為模板，應(yīng)用引物5、8 PCR合成基因啟動(dòng)子同源重組框，電泳割膠純化定量。PCR反應(yīng)體系同說(shuō)明書，原理見(jiàn)圖1。

基因槍轉(zhuǎn)化 挑取隱球菌單克隆，YPD培養(yǎng)基搖床過(guò)夜培養(yǎng)后制備感受態(tài)細(xì)胞，并均勻涂布在YPD+1M山梨醇平板上自然晾干。取純化定量后的基因啟動(dòng)子同源重組片段 (2 μg/5 μL)，依次加入10 μL 金珠 (0.6 μm，美國(guó) Bio-Rad)、10 μL CaCl2(2.5 M)和2.5 μL 亞精胺 spermidine(1 M)，振蕩混勻、室溫靜置、無(wú)水乙醇重懸后均勻涂布于載粒膜中心并風(fēng)干。啟動(dòng)基因槍，設(shè)置參數(shù)后激發(fā)開(kāi)關(guān)，將同源重組DNA片段轉(zhuǎn)入隱球菌感受態(tài)細(xì)胞;30℃培養(yǎng)箱孵育4 h后轉(zhuǎn)移至YPD+G418篩選培養(yǎng)基上孵育1周左右。

陽(yáng)性克隆的篩選與驗(yàn)證 從篩選培養(yǎng)基上挑出所有單克隆子，應(yīng)用試劑盒抽提其基因組DNA，分別應(yīng)用引物9和10、11和12行PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆子，并將初測(cè)正確的PCR產(chǎn)物送基因測(cè)序。經(jīng)PCR、測(cè)序驗(yàn)證正確后的菌株，分別置于含25 μM BCS或25 μM CuSO4的YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期，應(yīng)用試劑盒提取RNA、合成cDNA后，Real Time PCR比較目的基因UBI 1在兩種生長(zhǎng)條件下的表達(dá)水平，管家基因?yàn)锳CT 1(引物見(jiàn)表1)［8］。具體步驟詳見(jiàn)試劑盒。

2 結(jié) 果

2.1 隱球菌條件啟動(dòng)子重組質(zhì)粒的獲得

在應(yīng)用條件誘導(dǎo)性啟動(dòng)子定向調(diào)控新生隱球菌的基因表達(dá)時(shí)，常需應(yīng)用抗性基因篩選的方法將目的基因的啟動(dòng)子替換為條件啟動(dòng)子。我們首先應(yīng)用高保真酶PrimeStar行PCR擴(kuò)增，分別從質(zhì)粒載體pJAF1和pNAT/CTR4中獲得相應(yīng)的的抗性基因NEO(抗遺傳霉素基因)和銅離子抑制性啟動(dòng)子pCTR4片段，而后經(jīng)第2輪PCR將上述片段融合在一起。PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖2，NEO、pCTR4及融合DNA片段分別為2 010 bp、674 bp、2 664 bp，電泳條帶完全符合預(yù)期，提示NEO/CTR4融合片段構(gòu)建成功。

為了便于抗性基因-條件啟動(dòng)子融合片段長(zhǎng)期穩(wěn)定的保存，我們應(yīng)用 T-A克隆的方法將重組DNA片段載入 T載體 pMD18T以構(gòu)建新質(zhì)粒pNEO/CTR4。由于PrimeStar酶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為鈍性末端，NEO/CTR4片段經(jīng)rTaq酶在擴(kuò)增片段3＇端添加"A"尾后，再與T克隆載體相連，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10后獲得大量陽(yáng)性克隆子，而未加DNA片段的T載體轉(zhuǎn)化后結(jié)果為陰性。為了檢測(cè)新構(gòu)建重組質(zhì)粒的正確性，隨機(jī)挑取16個(gè)陽(yáng)性克隆子以引物3、4行菌落PCR檢測(cè)，所有擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳驗(yàn)證均為674bp，提示我們T-A克隆成功率100%(見(jiàn)圖3)。隨機(jī)選擇2號(hào)、16號(hào)克隆的PCR產(chǎn)物，經(jīng)基因測(cè)序驗(yàn)證完全正確，提示我們pNEO/CTR4重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 隱球菌目的基因UBI 1條件啟動(dòng)子重建株的構(gòu)建

為了檢測(cè)銅離子抑制性啟動(dòng)子CTR4在隱球菌基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控應(yīng)用中的可行性，我們?nèi)我膺x取了隱球菌基因UBI 1(CNAG_00370)為目的基因，通過(guò)構(gòu)建啟動(dòng)子同源重組框和基因槍轉(zhuǎn)化的方法實(shí)現(xiàn)啟動(dòng)子置換。經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)檢索，我們發(fā)現(xiàn)目的基因CNAG_00370同上游基因CNAG_00371共享同一個(gè)啟動(dòng)子。為了不妨礙上游基因的正常表達(dá)，我們以UBI 1基因起始密碼子為界，其上游約1 kb核苷酸 (含原始啟動(dòng)子)為5FR，起始密碼子下游約1 kb核苷酸 (基因編碼區(qū))為3FR，應(yīng)用同源重組原理在兩者之間插入條件啟動(dòng)子pCTR4(見(jiàn)圖1)。

5FR、3FR以及啟動(dòng)子同源重組框融合片段擴(kuò)增物的電泳結(jié)果見(jiàn)圖4，所有條帶大小符合預(yù)期，提示重組框融合片段構(gòu)建成功。大量擴(kuò)增、純化定量后，將其應(yīng)用基因槍轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入隱球菌感染態(tài)細(xì)胞，經(jīng)G418抗性培養(yǎng)基篩選后獲得數(shù)十個(gè)陽(yáng)性克隆子，而陰性對(duì)照無(wú)菌落，提示操作正確 (見(jiàn)圖5)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證陽(yáng)性菌落條件啟動(dòng)子插入位置的正確性，我們?cè)O(shè)計(jì)引物9-12進(jìn)行PCR驗(yàn)證，其中引物9、12分別位于5FR和3FR的上游、下游，而引物10、11則位于NEO抗性基因內(nèi) (見(jiàn)圖1)，僅當(dāng)啟動(dòng)子定向置換成功方可擴(kuò)增出預(yù)期條帶。驗(yàn)證PCR結(jié)果如圖6，條帶大小符合預(yù)期，而且相應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)DNA測(cè)序、核苷酸比對(duì)后完全正確 (結(jié)果未展示)，提示我們條件啟動(dòng)子置換成功，新生隱球菌重建株ZJY01-ZJY03(CTR 4(p)-UBI 1::NEO)構(gòu)建正確。

2.3 條件啟動(dòng)子對(duì)UBI 1基因在不同條件下轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控

我們應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR分析檢測(cè)了pCTR4啟動(dòng)子在銅離子螯合和豐富銅離子兩種生長(zhǎng)條件下對(duì)目的基因UBI 1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響。引物設(shè)計(jì)是決定實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果的重要影響因素，為了避免基因組DNA的干擾影響，通?？缭交蚪MDNA內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計(jì)引物，我們應(yīng)用Primer3軟件獲得跨越內(nèi)含子S3區(qū)域的下游引物 (見(jiàn)圖7)。獲得隱球菌基因組RNA合成cDNA后，我們首先應(yīng)用普通PCR檢測(cè)了RT-PCR引物的可行性，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖7所示，條帶特異無(wú)雜帶且敏感性較好，符合預(yù)期大小 (UBI 1片段為204 bp，ACT 1片段為186 bp)，提示引物設(shè)計(jì)良好。

進(jìn)一步比較檢測(cè)了3個(gè)隱球菌條件啟動(dòng)子重建株(ZJY01-ZJY03)在誘導(dǎo)性(銅離子螯合劑25 μM BCS)和抑制性 (豐富銅離子25 μM CuSO4)生長(zhǎng)條件下目的基因UBI 1的表達(dá)情況 (見(jiàn)圖8)。較之25 μM CuSO4培養(yǎng)條件，3 個(gè)菌株在 25 μM BCS培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期時(shí)UBI 1基因的表達(dá)水平顯著升高約16～27倍 (P＜0.001)，3個(gè)菌株在同一條件下UBI 1基因的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果符合預(yù)期，提示我們已成功應(yīng)用pCTR4啟動(dòng)子對(duì)目的基因?qū)崿F(xiàn)條件性誘導(dǎo)或抑制。

3 討 論

在本研究中，我們順利構(gòu)建了條件啟動(dòng)子相關(guān)質(zhì)粒pNEO/CTR4，以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步論證了該啟動(dòng)子在隱球菌泛素基因UBI 1條件誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄調(diào)控應(yīng)用中的可行性。銅離子抑制性條件啟動(dòng)子來(lái)源于高親和力銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CTR 4，該基因表達(dá)由DNA耦聯(lián)蛋白Cuf1調(diào)控，在低銅離子 (銅離子螯合劑BCS)條件下，Cuf1與pCTR4中的銅離子感應(yīng)元件CuSE相結(jié)合從而顯著增強(qiáng)基因CTR 4的轉(zhuǎn)錄表達(dá);相反，如果在富含銅離子生長(zhǎng)條件下，則Cuf1為外源性銅離子競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，對(duì)pCTR4中CuSE元件親和力顯著下降從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［4］。

目前，國(guó)外學(xué)者已先后應(yīng)用該啟動(dòng)子鑒定證實(shí)了隱球菌中蘇氨酸、脂肪酸合成通路中相關(guān)基因HOM 3、THR 1、FAS 1、FAS 2均為致死性關(guān)鍵基因［7，9］。上述研究均以 pNAT/CTR4 為基礎(chǔ)，應(yīng)用諾爾斯菌素抗性基因NAT作為篩選標(biāo)記進(jìn)行啟動(dòng)子同源置換。與之不同的是，本研究對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行了改造，轉(zhuǎn)而應(yīng)用遺傳霉素抗性基因NEO作為篩選標(biāo)記重新構(gòu)建質(zhì)粒pNEO/CTR4，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)隱球菌基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，首次證實(shí)遺傳霉素抗性基因?qū)︺~離子抑制啟動(dòng)子無(wú)功能影響，可作為pCTR4的有效報(bào)告基因。較之遺傳霉素，諾爾斯菌素價(jià)格十分昂貴，而且目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)同類產(chǎn)品，嚴(yán)重制約了國(guó)內(nèi)隱球菌相關(guān)的基因研究，因此新建質(zhì)粒pNEO/CTR4具有重要的應(yīng)用前景。

我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，較之高銅離子條件，銅離子螯合后目的基因表達(dá)顯著升高，最高可達(dá)27倍，而文獻(xiàn)報(bào)道最高可誘導(dǎo)增強(qiáng)表達(dá)276倍［4］。這種差異可能源于實(shí)驗(yàn)條件的選擇，本研究應(yīng)用25 μM BCS而文獻(xiàn)報(bào)道中為200 μM BCS，不同濃度銅離子螯合劑的應(yīng)用可能導(dǎo)致培養(yǎng)基中銅離子殘余量上的差異，從而導(dǎo)致Cuf1p對(duì)條件啟動(dòng)子pCTR4親和力的改變最終決定了目的基因的轉(zhuǎn)錄水平差異。因此，條件啟動(dòng)子pCTR4除了可以用于鑒定致死性關(guān)鍵基因外，還可用于研究基因表達(dá)水平與功能效應(yīng)關(guān)系。國(guó)外學(xué)者已成功應(yīng)用該原理，證實(shí)了隱球菌轉(zhuǎn)錄因子ZNF 1表達(dá)水平與菌絲產(chǎn)生水平呈顯著的正相關(guān)［10］。

圖1 利用套疊PCR構(gòu)建目的基因條件啟動(dòng)子重建株的示意圖 圖2 套疊PCR構(gòu)建NEO/CTR4重組片段:L1.NEO抗性基因片段，L2.pCTR4條件啟動(dòng)子片段，L3.NEO/CTR4融合片段 圖3 重組質(zhì)粒pNEO/CTR4煮菌PCR驗(yàn)證電泳結(jié)果 圖4 套疊PCR合成基因啟動(dòng)子同源重組框:L1.5＇端同源重組區(qū) (5FR)，L2.3＇端同源重組區(qū) (3FR)，L3.5FR+NEO/CTR4+3FR三段融合而成的條件啟動(dòng)子子同源重組框圖5 抗性培養(yǎng)基篩選出的陽(yáng)性克隆:a.條件啟動(dòng)子重組框經(jīng)基因槍轉(zhuǎn)化后以YPD+G418抗性培養(yǎng)基篩選出來(lái)的陽(yáng)性克隆子;b.H99在抗性培養(yǎng)基中的空白對(duì)照 圖6 條件啟動(dòng)子重組菌株陽(yáng)性克隆子的PCR驗(yàn)證:L1，L5.以隱球菌標(biāo)準(zhǔn)株H99基因組DNA為模板，L2，L6.對(duì)于重建株ZJY01，L3，L7.對(duì)于重建株ZJY02，L3，L7.對(duì)于重建株ZJY03;L1～L4為引物11和12的擴(kuò)增產(chǎn)物，L5～L8為引物9和10的擴(kuò)增產(chǎn)物 圖7 實(shí)時(shí)定量PCR引物設(shè)計(jì)與檢測(cè):a.引物設(shè)計(jì)，P為啟動(dòng)子區(qū)，T為終止子區(qū)，S1～S4為基因組DNA內(nèi)含子片段;b.引物檢測(cè)，L1為UBI1片段常規(guī)PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物204 bp，L2為管家基因ACT1的擴(kuò)增產(chǎn)物186 bp 圖8 兩種生長(zhǎng)條件下條件啟動(dòng)子誘導(dǎo)UBI 1基因表達(dá)水平的變化。1～3分別為隱球菌重建菌株ZJY01、ZJY02、ZJY03(CTR 4(p)-UBI 1::NEO)。以ACT1為管家基因，三個(gè)菌株在銅離子螯合生長(zhǎng)條件(BCS)下較之豐富銅離子生長(zhǎng)條件下，基因UBI 1均表現(xiàn)為顯著上調(diào)表達(dá)(P＜0.001)Fig.1 Sketch map of conditional promoter reconstitutional strain with overlap PCR Fig.2 Construction of fused fragment NEO/CTR4 with overlap PCR Fig.3 Verification of reconstitution vector pNEO/CTR4 via colony PCR Fig.4 Construction of promoter replacement recombination cassette with overlap PCR Fig.5 Positive colonies of Cryptococcus neoformans reconstitution strain in YPD medium plus G418 Fig.6 Confirmation of conditional promoter reconstitution strains via diagnostic PCR Fig.7 Design and quality testing of Real-Time PCR primers Fig.8 Expression of target gene UBI 1 induced by conditional promoter under different growth conditions

除了銅離子抑制性啟動(dòng)子之外，可用于隱球菌基因功能研究的條件啟動(dòng)子還有半乳糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子pGAL7和交配誘導(dǎo)啟動(dòng)子pMFα1。pGAL7在葡萄糖存在時(shí)表達(dá)抑制，而半乳糖存在時(shí)表達(dá)顯著增強(qiáng)［3］，然而不同的碳源利用通路對(duì)隱球菌致病感染具有重要的影響［11］，該條件啟動(dòng)子在隱球菌碳源利用相關(guān)的基因功能研究方面存明顯受限。而pMFα1僅在 V8交配培養(yǎng)基中方可誘導(dǎo)基因表達(dá)［5］，然而隱球菌在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率較慢且可誘導(dǎo)擔(dān)孢子產(chǎn)生，極大地限制了其作為基因表達(dá)調(diào)控研究的分子生物學(xué)工具。與上述兩個(gè)條件啟動(dòng)子相似，pCTR4對(duì)隱球菌銅離子利用相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控研究存在一定的影響，但除此之外的基因功能研究具有廣泛的適用性。因此，三個(gè)條件啟動(dòng)子(尤其pCTR4和pGAL7)相互補(bǔ)充，是隱球菌功能基因組學(xué)研究的重要工具。

泛素系統(tǒng)是真核生物中普遍存在的重要蛋白修飾機(jī)制，主要參與細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)激應(yīng)答、蛋白質(zhì)控等多種重要的生物學(xué)過(guò)程，對(duì)隱球菌、念珠菌等多種病原真菌的生長(zhǎng)和毒力具有多效調(diào)控作用［12-15］。而本研究中的目的基因UBI 1是僅有的兩個(gè)隱球菌泛素前體蛋白編碼基因之一，主要表達(dá)單體泛素分子耦聯(lián)一個(gè)核糖體蛋白［16］。前期工作中我們應(yīng)用同源重組方法多次試圖敲除它均未獲成功，通過(guò)條件啟動(dòng)子pCTR4的同源置換研究，我們首次證實(shí)UBI 1基因并非新生隱球菌的致死性關(guān)鍵基因，為后續(xù)的基因功能機(jī)制研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

4 致 謝

感謝美國(guó)杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)中心John R Perfect教授為我們提供的菌株和質(zhì)粒。

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