白木香果皮提取物清除DPPH自由基能力及抑制酪氨酸酶活性的研究

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1.廣東省微生物研究所，省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實驗室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實驗室，廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室，廣東 廣州510070；2.廣東藥學(xué)院，廣東 廣州510006

白木香果皮提取物清除DPPH自由基能力及抑制酪氨酸酶活性的研究

李浩華1章衛(wèi)民1*陳玉嬋1高曉霞2嚴(yán)寒靜2

1.廣東省微生物研究所，省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實驗室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實驗室，廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室，廣東 廣州510070；2.廣東藥學(xué)院，廣東 廣州510006

目的研究白木香果皮不同溶劑提取物清除DPPH自由基的能力及對酪氨酸酶活性的抑制作用，為白木香果皮的應(yīng)用和開發(fā)提供理論依據(jù)。方法以水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和石油醚5種極性不同的溶劑，采用回流、超聲、冷浸方法提取白木香果皮，采用DPPH法和L-DOPA法分別測定提取物對DPPH自由基的清除能力和酪氨酸酶活性的抑制作用。結(jié)果極性較大的水、乙醇提取物對DPPH自由基均有顯著的清除能力，其IC50值分別為26.9、19.9μg/ml；而極性中等的丙酮、乙酸乙酯提取物則對酪氨酸酶活性具有較為明顯的抑制作用，其IC50值分別為93.2、122.9μg/ml。結(jié)論白木香果皮提取物具有開發(fā)天然有效的自由基清除劑和酪氨酸酶抑制劑的潛力。

白木香果皮；提取物；DPPH；酪氨酸酶

白木香Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg為瑞香科沉香屬植物，是一種熱帶、亞熱帶常綠喬木，分布于廣東、廣西、海南、云南及臺灣等地，為我國唯一產(chǎn)沉香的植物資源[1]。沉香是我國傳統(tǒng)珍貴中藥，具有行氣止痛，溫中止嘔，納氣平喘之功效，主治胸腹脹悶疼痛，胃寒嘔吐呃逆，腎虛氣逆喘急等癥[2]，臨床用于治療寒性胃痛、老年性腸梗阻、便秘、哮喘等[3]。目前對白木香的利用主要通過人工造香使其樹干產(chǎn)生沉香藥材，但由于結(jié)香周期長，且采香后其余材料被廢棄，以致對白木香資源的利用率很低。為提高該植物資源利用率和經(jīng)濟(jì)效益，人們開始關(guān)注白木香果、葉的開發(fā)研究。白木香樹每年可產(chǎn)生大量的果實，是一種具有開發(fā)潛力的可再生資源，研究表明白木香果實及種子分別具有抗腫瘤和抗菌活性[4、5]。為了進(jìn)一步發(fā)掘白木香果皮的新用途和功能，本研究通過DPPH法和L-DOPA法對白木香果皮提取物進(jìn)行DPPH自由基清除能力和酪氨酸酶活性抑制作用的研究，以期為白木香果皮的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材、試劑

1.1 材料 白木香果實由廣東省信宜市珍稀沉香發(fā)展有限公司提供，經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院嚴(yán)寒靜副教授鑒定為白木香Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg的果實。果實置于室內(nèi)陰干，將種子從果實中去除后即為果皮，保存于廣東省微生物研究所。

1.2 試劑 2,2-二苯基-1-苦肼基(DPPH)、維生素C、酪氨酸酶(Tyrosinase，3933 U/mg)、3,4-二羥基苯丙氨酸(L-dopa)，均購自Sigma公司；其余試劑均為分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠。

1.3 主要儀器 RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；超凈工作臺(上海恒益科技有限公司)；Multiskan酶標(biāo)儀(Thermo公司)。

2 方法

2.1 不同溶劑的白木香果皮提取物制備

2.1.1 水提取物的制備 將白木香果皮用純凈水100 ℃回流提取2次，每次2 h，過濾，合并2次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，得白木香果皮水提物浸膏。

2.1.2 乙醇提取物的制備 將白木香果皮用70%乙醇在超聲波頻率為40 KHz下超聲提取2次，每次30 min，過濾，合并2次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，得乙醇提取物浸膏。

2.1.3 丙酮提取物的制備 將白木香果皮用丙酮60 ℃回流提取2次，每次2 h，過濾，合并2次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，得丙酮提取物浸膏。

2.1.4 乙酸乙酯提取物的制備 將白木香果皮用乙酸乙酯80 ℃回流提取2次，每次2 h，過濾，合并2次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，得乙酸乙酯提取物浸膏。

2.1.5 石油醚提取物的制備 將白木香果皮用石油醚冷浸2次，每次24 h，過濾，合并2次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，得石油醚提取物浸膏。

2.2 白木香果皮提取物清除DPPH自由基能力的測定

2.2.1 不同提取物清除DPPH自由基能力的測定 參照Turkoglu等[6]方法，將白木香果皮各提取物和維生素C用無水乙醇配制成濃度為400μg/ml溶液，DPPH用無水乙醇配制成0.2mmol/L的溶液。吸取提取物溶液100μl于96孔板中，加入濃度為0.2mmol/L的DPPH溶液100μl作樣品組，以無水乙醇溶液作參比溶液，以無水乙醇代替DPPH溶液作樣品背景組，以無水乙醇代替提取物溶液作陰性對照組，以維生素C溶液代替提取物溶液作陽性對照組，置30 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀測定每孔517 nm處的吸光值(A)，按以下公式計算提取物對DPPH自由基的抑制率：清除率(%)={1-(A樣品組/陽性組-A背景組)/A陰性組}×100%。

2.2.2 不同濃度的提取物清除DPPH自由基能力的測定 將白木香各提取物溶液用無水乙醇稀釋至400、200、100、50、25、12.5、6.25μg/ml，按“2.2.1”項的測定方法測吸光值，計算提取物對DPPH自由基的抑制率，并采用SigmaPolot 10.0 軟件計算對DPPH自由基清除的IC50值。

2.2.3 不同作用時間下清除自由基能力的測定 將各提取物溶液用無水乙醇溶液稀釋至200μg/ml，按“2.2.1”項的測定方法測吸光值，每隔10min測定1次，共測定7次，觀察白木香果皮各提取物在不同作用時間下對DPPH自由基清除能力的影響。

2.3 抑制酪氨酸酶活性的測定 參照二酚酶活力的測定方法[7]，將白木香果皮各提取物用DMSO溶解，用pH6.8的PBS緩沖液分別稀釋至5000、2000、1000、500、200μg/ml，酪氨酸酶和L-dopa用PBS緩沖液分別配制成活力為10 U/ml和濃度為10 mmol/L溶液。以L-dopa溶液為底物，吸取該溶液160μL于96孔板中，加入20μl各濃度提取物稀釋液及20μl酪氨酸酶溶液作樣品組，以PBS緩沖液作參比，以PBS緩沖液代替酪氨酸酶溶液作樣品背景組，以PBS緩沖液代替提取物溶液作陰性對照組，置37℃培養(yǎng)箱靜止作用30 min，用酶標(biāo)儀測定每孔475nm處的吸光值(A)，按以下公式計算白木香果皮各提取物對酪氨酸酶活性的抑制率，并采用SigmaPolot 10.0 軟件計算IC50值。抑制率(%)={1-(A樣品組/陽性組-A背景組)/A陰性組}×100%。

3 結(jié)果

3.1 白木香果皮提取物清除DPPH自由基的能力 白木香果皮的不同溶劑提取物(水、乙醇、乙酸乙酯、丙酮)在200μg/ml濃度下對DPPH自由基均有顯著的清除能力，清除率均達(dá)95%以上，在相同濃度下與維生素C的清除能力相當(dāng)，而石油醚提取物對DPPH自由基則幾乎沒有清除作用，結(jié)果見表1。

3.2 不同濃度提取物清除DPPH自由基的能力 不同溶劑提取的白木香果皮提取物對自由基的清除能力不同，其IC50值由小到大依次為：乙醇提取物、水提取物、丙酮提取物、乙酸乙酯提取物。另外，不同溶劑的提取物對自由基的清除率與其濃度大小成正比，濃度越高，其清除能力越強(qiáng)，呈一定的量效關(guān)系，結(jié)果見表2。

表1 不同溶劑的提取物對DPPH自由基的清除能力±s, n=3)

表2 不同濃度的提取物對DPPH自由基清除率

表3 不同作用時間下對DPPH自由的基清除率

表4 對酪氨酸酶活性的抑制率(%)

注：“-”代表對酪氨酸酶活性有激活的作用；“N”表示未計算IC50值。

3.3 不同作用時間下對DPPH自由基的清除能力 白木香各提取物在200μg/ml濃度下對DPPH自由基清除能力均隨作用時間的延長而增強(qiáng)，在作用30min時，清除率在85%～90%之間，當(dāng)作用30 min后，各提取物對自由基的清除率則均趨于穩(wěn)定，結(jié)果見表3。

3.4 白木香果皮提取物對酪氨酸酶活性的抑制作用 白木香果皮的丙酮提取物和乙酸乙酯提取物在500μg/ml濃度下，對酪氨酸酶活性具有一定的抑制作用，抑制率均達(dá)75%以上，IC50值分別為93.2和122.9μg/ml，水提物、乙醇提取物和石油醚提取物對酪氨酸酶的抑制作用則不明顯，結(jié)果見表4。

4 討論

本研究結(jié)果表明白木香果皮提取物具有清除DPPH自由基的能力和抑制酪氨酸酶活性的作用。不同溶劑提取的白木香果皮提取物對DPPH自由基的清除能力明顯不同，其中用極性較大或中等的溶劑(水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯)得到的提取物對DPPH自由基具有顯著的清除能力，而用極性小的石油醚得到的提取物對自由基則幾乎沒有清除能力，說明白木香果皮提取物中清除自由基的主要活性成分可能為極性較大或中等的物質(zhì)。由于水提物和醇提物清除DPPH自由的IC50值均較低，因此，從開發(fā)天然抗氧化劑的成本考慮，利用水提比較合適。此外，不同溶劑提取的白木香果皮提取物對酪氨酸酶活性的抑制作用也不同，其中用中等極性的丙酮、乙酸乙酯得到的提取物對酪氨酸酶活性的抑制作用較為明顯，而用極性大的水、乙醇和極性小的石油醚得到的提取物對酪氨酸酶的抑制作用不明顯，說明白木香果皮提取物中抑制酪氨酸酶活性的主要成分可能為中等極性的物質(zhì)。

白木香果實資源豐富，但人們采集果實后，除了種子用于育苗外，果皮部分被廢棄。為充分利用白木香果皮這一廢棄資源，作者曾對白木香果皮的三氯甲烷提取物進(jìn)行化學(xué)成分分析，發(fā)現(xiàn)其果皮中含有大量的沉香特征性成分，且該提取物對腫瘤細(xì)胞株具有抑制活性[8]和廣譜的抗菌活性[9]。本研究結(jié)果進(jìn)一步顯示白木香果皮具有多種生物活性，為今后進(jìn)一步通過活性跟蹤分離提取不同活性的有效成分奠定了基礎(chǔ)，同時也為今后對白木香果皮的應(yīng)用和開發(fā)提供了理論依據(jù)。

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StudyonscavengingDPPHfreeradicalactivityandinhibitoryeffectontyrosinaseofAquilariasinensispeelextract

LI Hao-hua1ZHANG Wei-min1*CHEN Yu-chan1GAO Xiao-xia2YAN Han-jing2

1.State Key Laboratory of Applied Microbiology, South China (The Ministry—Province Joint Development), Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application; Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology; Guangdong Institute of Microbiology, Guangzhou 510070, China; 2.Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006, China

Objective: To evaluate the scavenging DPPH free radical activity and inhibitory effect on tyrosinase of Aquilaria sinensis peel extract, thus providing a theoretical basis for the application and development of A. sinensis peel. Method: Water, ethanol, buthanol, ethyl acetate and petroleum ether were used as solvents, and reflux, ultrasonic wave, soaking were employed to extract peel of A. sinensis. The radical scavenging activity and inhibitory effect on tyrosinase were determined by the DPPH assay and L-DOPA assay, respectively. Results: Water and ethanol extracts exhibited significant scavenging capabilities on DPPH free radical with the IC50 values of 26.9, 19.9μg/ml, respectively. The buthanol and ethyl acetate extracts of A.sinensis peel displayed good tyrosinase inhibitory activities with the IC50 values of 93.2, 122.9μg/ml, respectively. Conclusion: The extract of A. sinensis peel has the potential to explore effective natural free radical scavengers and tyrosinase inhibitors.

Aquilaria sinensis peel; extract; DPPH; tyrosinase

廣東省中國科學(xué)院全面戰(zhàn)略合作項目(2011B090300078)；廣東省科技計劃項目(2012A030100014)。

李浩華，女，助理研究員，主要從事藥用微生物資源及其活性物質(zhì)研究。E-mail:hhli100@126.com.

章衛(wèi)民，E-mail:wmzhang58@qq.com.

R285.5

A

1007-8517(2014)08-0036-03

2014.03.17)