干旱脅迫下老芒麥遺傳多樣性分析

陳 云，閆偉紅，吳 昊，曲志才

(1.曲阜師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273165；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

水分脅迫是植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中最易遭受到的生態(tài)脅迫因子[1]。研究報(bào)道，植物的抗旱性包括系統(tǒng)抗旱性和細(xì)胞抗旱性，二者都是由于植物體內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)的結(jié)果[2]。小麥對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)過程包括脅迫感受、滲透調(diào)控反應(yīng)、激素反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控、氣孔運(yùn)動(dòng)、形態(tài)及生長(zhǎng)速率變化等多個(gè)環(huán)節(jié)的協(xié)同作用，是一個(gè)多途徑、多水平的調(diào)控過程。這個(gè)過程同時(shí)也是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中經(jīng)過自然選擇與人工選擇而獲得的對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性過程[3]。植物抗旱性和遺傳多樣性是環(huán)境選擇的結(jié)果，評(píng)價(jià)植物的抗旱性和遺傳多樣性可以了解它們的生態(tài)適應(yīng)性，為研發(fā)和推廣抗旱品種提供理論依據(jù)。

有關(guān)植物種質(zhì)資源抗旱性的評(píng)價(jià)，國內(nèi)外已有許多報(bào)道，但大多側(cè)重于植物形態(tài)及生理生化特性等方面。曾怡[4]以川西北高原的野生老芒麥種質(zhì)資源為供試材料，通過對(duì)萌發(fā)期、苗期至開花期干旱脅迫條件下的生理生化、生長(zhǎng)特性、生物量等指標(biāo)的觀測(cè)，探討了干旱脅迫對(duì)老芒麥的影響，篩選出鑒定老芒麥抗旱性的重要指標(biāo)。對(duì)以色列野生二粒小麥的研究發(fā)現(xiàn)，不同生態(tài)區(qū)干旱脅迫環(huán)境造成非編碼區(qū)的微衛(wèi)星序列的遺傳變異和分化，致使其重復(fù)次數(shù)發(fā)生相應(yīng)變化[5]。Esmaeilzadeh等[6]以AFLP分子標(biāo)記和某些農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)面包小麥基因型耐旱的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)AFLP分析的聚類結(jié)果與農(nóng)藝性狀的聚類存在相關(guān)性。對(duì)棉花耐旱相關(guān)種質(zhì)的遺傳多樣性分析表明，高抗材料之間的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，其抗旱性來源于不同的遺傳基礎(chǔ)，而不抗旱材料之間的遺傳關(guān)系較近[7]。韓瑞宏等[8]研究了干旱條件下草坪草的生態(tài)適應(yīng)性,細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、葉綠體超微結(jié)構(gòu)的變化,草坪草對(duì)干旱脅迫的生理生化反應(yīng),以及提高草坪抗旱性的途徑。至于干旱脅迫對(duì)老芒麥遺傳多樣性的影響，國內(nèi)外報(bào)道較少。從干旱脅迫下遺傳特性響應(yīng)機(jī)制方面，研究不同生境下老芒麥耐旱的遺傳特性，為篩選高抗旱性材料，合理開發(fā)老芒麥種質(zhì)資源和遺傳育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料老芒麥均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所提供，所有材料均采自野外，經(jīng)異地?cái)U(kuò)繁及農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)，從中篩選出20份性狀優(yōu)異的老芒麥，其物候期較長(zhǎng)、穗大、牧草產(chǎn)量高、抗逆性較強(qiáng)(表1)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 稱取每份材料100 mg，液氮研磨至粉狀后，采用改良的CTAB法提取老芒麥基因組DNA[9,10]，以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試材料老芒麥序號(hào)及產(chǎn)地Table 1 The information of tested Elymus sibiricus

1.2.2 SSR-PCR 參照文獻(xiàn)[11]的體系加以優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)的最適體系為20 μL反應(yīng)體系，即25 mmol/L MgCl21.6μL，2.5 mmol/L dNTP 1.5 μL，10(Buffer緩沖液2.0 μL，10 μmol/L上下游引物各0.6 μL，1 UTaqDNA聚合酶0.2 μL，模板DNA 0.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性60 s，50～59 ℃退火45 s (依具體引物對(duì)而定)，72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

在老芒麥PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜中，每個(gè)條帶視為一個(gè)基因位點(diǎn)，按同一位置上DNA條帶的有無進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有帶的標(biāo)記為“1”，無帶的標(biāo)記為“0”，缺失記為“2”，得到1，0數(shù)據(jù)矩陣。分別應(yīng)用NTSYSpc2.1[12]軟件和POPGEN 32軟件，以非加權(quán)組平均法(UPGMA) 為手段進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 老芒麥基因組DNA提取及電泳鑒定

以改良的CTAB法提取的老芒麥基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，大部分材料的基因組DNA純度較高、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)殘留較少，可用于SSR標(biāo)記分析。

2.2 SSR分子標(biāo)記檢測(cè)

用PEG-6000模擬自然狀態(tài)下的干旱環(huán)境，對(duì)20份地理距離遠(yuǎn)且形態(tài)學(xué)差異較大的供試?yán)厦Ⅺ湶牧线M(jìn)行脅迫處理，然后篩選出多態(tài)性高、條帶清晰、重復(fù)性好的10對(duì)引物進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增，總擴(kuò)增帶數(shù)115條，大小多集中在500～2 000 bp，平均每個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增出11.5條(圖2)，其中，多態(tài)性帶數(shù)為103條，占總條帶數(shù)的89.57%，平均每個(gè)引物對(duì)產(chǎn)生10.3條(表2)；多態(tài)性信息含量(PIC)為0.255～0.473，平均為{0.368})，SSR標(biāo)記效率(MI)為3.87(表2)；多態(tài)性條帶百分率在70%～100%，表明老芒麥有很豐富的遺傳多樣性。

2.3 供試材料的遺傳距離分析

擴(kuò)增產(chǎn)物采用Nei[13]的計(jì)算方法得到供試材料的遺傳距離矩陣，20份老芒麥的遺傳距離值在1.03～9.97(表3)；由矩陣圖可以看出，來自內(nèi)蒙錫盟太旗崩崩山試驗(yàn)地的13號(hào)材料和來自新疆伊犁州特克斯縣城北種牛場(chǎng)的14號(hào)材料之間的遺傳距離最小，表明二者親緣關(guān)系較近；而來自新疆博州溫泉縣西阿拉套山口的3號(hào)材料和來自新疆伊犁州昭蘇縣城北的4號(hào)材料之間的遺傳距離最大，說明二者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這也反映了同一產(chǎn)地的老芒麥材料之間親緣關(guān)系并非較近，產(chǎn)地距離較遠(yuǎn)的老芒麥材料之間親緣關(guān)系也并非較遠(yuǎn)，這一趨勢(shì)與干旱脅迫之前的結(jié)果一致。

圖1 46-47引物對(duì)對(duì)20份老芒麥的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR product of 20 accessions of Elymus sibiricus amplified by 46～47 primer pairs

注：泳道M,DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(DL 2000)，1～20號(hào)泳道對(duì)應(yīng)表1中的1～20號(hào)材料的基因組DNA擴(kuò)增結(jié)果

表2 SSR引物序列及其擴(kuò)增結(jié)果Table 2 The SSR primer sequences and its amplification

表3 20份老芒麥品種間的遺傳距離Table 3 The genetic distance of 20 accessions of Elymus sibiricus based on the software of Ntsyspc-2.10

注：根據(jù)Ntsyspc-2.10軟件得出

經(jīng)POPGENE 32軟件處理，可知老芒麥居群間的遺傳距離介于0.160 0～0.894 8(表4)，差異比較大，表明干旱脅迫后的老芒麥的遺傳差異性較高，遺傳變異較廣。

表4 20份老芒麥之間的遺傳距離Table 4 The genetic distance of 20 accessions of Elymus sibiricus based on the software of POPGENE 32

注：根據(jù)POPGENE 32軟件得到

2.4 干旱脅迫前后的聚類分析

2.4.1 以NTSYSpc 2.1軟件處理的聚類圖與三維圖 干旱脅迫前的聚類圖表明，在遺傳距離為0.57處20份供試材料被聚為兩類，來自西藏的18,19號(hào)材料聚為一類，其余的材料聚為一類，在遺傳距離為0.62處第1大類又被分為2類(圖2)，即1,2,3,14,4,5,15,16聚在一起，6,9,10,8,7,11,13,17,12聚在一起。

脅迫處理后的老芒麥，在遺傳距離為0.36處分為兩類，即Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ兩大類，除7號(hào)材料外其余材料歸為一類，在遺傳距離為0.50處第Ⅰ大類又被分為Ⅰ和Ⅱ兩類(圖2B)，1，10，2，3，4，5，8，13，14，15，16，6，9，12聚為一類。

圖2 干旱脅迫處理前(A)后(B)老芒麥的類平均法聚類Fig.2 The cluster dendrogram using average linkage clustering of Elymus sibiricus before and after drought stress treatments

以相同軟件構(gòu)建的老芒麥材料的三維聚類圖可以非常直觀地反映所測(cè)試居群的整體結(jié)構(gòu)(圖3)。但脅迫前后的三維圖差別比較明顯。

2.4.2 以POPGENE 32軟件處理的聚類圖 由圖4可以看出不同軟件處理的聚類結(jié)果基本一致，且脅迫前的聚類結(jié)果明顯不同于脅迫后的聚類結(jié)果。

2.4.3 干旱脅迫前后的聚類結(jié)果比較 比較干旱脅迫前后的聚類結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脅迫前來自新疆的4、5號(hào)材料聚為一類，而干旱處理后4號(hào)卻與同樣來自新疆的2、3號(hào)聚在一起，5號(hào)材料與來自甘肅的8號(hào)材料聚為一類；脅迫前來自內(nèi)蒙的7號(hào)和13、17號(hào)聚在一起，而處理后7號(hào)卻單獨(dú)聚為一類；脅迫前來自內(nèi)蒙的10號(hào)材料與來自新疆的6、9號(hào)，甘肅的8號(hào)材料聚在一起，而脅迫處理后10號(hào)卻與來自新疆的1號(hào)聚在一起，這表明干旱脅迫前后聚類結(jié)果差別較大。

圖3 干旱脅迫處理前(A)后(B)老芒麥的三維圖Fig.3 Three dimensional diagram of 20 accessions of Elymus sibiricus before and after drought stress treatments

注：A,B,C分別對(duì)應(yīng)圖2中的Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ

圖4 干旱脅迫處理前(A)后(B)老芒麥的類平均法聚類Fig.4 Figure 2 The cluster dendrogram using average linkage clustering of Elymus sibiricus before and after drought stress treatments

3 討論

3.1 脅迫處理前材料的遺傳多樣性分析

干旱脅迫處理前聚類(圖2A)表明，采自新疆的1,2,3,14,4,5號(hào)材料聚在一起，采自內(nèi)蒙的7,13,17號(hào)材料聚在一起，采自西藏的18，19號(hào)材料聚在一起，表明產(chǎn)地相同的材料大多聚為一類，但同樣是采自青海的12和15號(hào)材料，同樣是采自內(nèi)蒙的10號(hào)和16號(hào)材料卻不聚在一起，表明聚類結(jié)果與其地理來源并非完全一致。其原因可能有兩方面，一是有些地區(qū)采集的樣本數(shù)量有限，例如山西和青海地區(qū)僅采集了一份樣本，這在一定程度上使得聚類結(jié)果精確性降低，研究報(bào)道表明遺傳多樣性水平和群體樣本數(shù)量間存在明顯的相關(guān)性，為此，未來在采樣時(shí)應(yīng)充分考慮樣本數(shù)量和采集地范圍的大小，減小因材料數(shù)量太少、來源過于集中對(duì)研究結(jié)果造成的影響[14-16]。二是基因突變，不同產(chǎn)地的樣本在異地?cái)U(kuò)繁多年，受擴(kuò)繁環(huán)境的影響程度不同，以及對(duì)不利環(huán)境的耐受性不同，可能引起耐受性低的材料有關(guān)基因發(fā)生突變，并且這種變異能夠遺傳。

3.2 脅迫處理后材料的遺傳多樣性分析

20份老芒麥的SSR-PCR分析顯示多態(tài)性條帶百分率在70%～100%，而不同地域居群間的遺傳距離介于0.160 0～0.894 8，差異比較大，說明其遺傳分化程度較高，遺傳多樣性豐富，遺傳變異較廣。多態(tài)性信息含量(PIC)為0.255～0.473，平均為0.368，SSR標(biāo)記效率(MI)為3.87，說明運(yùn)用SSR分子標(biāo)記能夠較好地揭示野生老芒麥的遺傳多樣性及親緣關(guān)系。

試驗(yàn)研究中，供試材料的Nei’s 遺傳多樣性指數(shù)(He)為0.332 4，明顯高于單子葉植物Nei’s 遺傳多樣性的平均值0.190[17]，Shannon’s 信息多樣性指數(shù)Ho為0.492 6，同樣表明老芒麥不同居群間的遺傳多樣性較高。從DNA分子水平上證實(shí)了老芒麥遺傳多樣性豐富，有大量可供選擇利用的優(yōu)異性狀和種質(zhì)資源[16]。因此，應(yīng)深入研究和合理開發(fā)利用老芒麥遺傳種質(zhì)資源，提高其產(chǎn)量和擴(kuò)大種植范圍，提高其利用率。

脅迫處理后的聚類圖(圖2B)表明，第Ⅰ大類中1,2,3,4,5,14,6,9均采自新疆，但6號(hào)和9號(hào)與其他6份材料遺傳距離仍然較遠(yuǎn)，15和12號(hào)材料均采自青海，但二者遺傳距離也較遠(yuǎn)，其原因與脅迫前相同，主要是耐受異地環(huán)境影響的能力不同。

脅迫后原來與新疆6號(hào)和9號(hào)聚在一起的內(nèi)蒙10號(hào)材料卻與新疆的1,2,3,4,5號(hào)材料聚在一起，之前與內(nèi)蒙13,17號(hào)材料聚在一起的7號(hào)材料在干旱處理后卻單獨(dú)聚為一類，脅迫前內(nèi)蒙13,17號(hào)材料遺傳距離較近，經(jīng)干旱處理后遺傳距離變得較遠(yuǎn)，推測(cè)其原因可能是采自內(nèi)蒙的供試材料由于適應(yīng)了特定的生境條件，對(duì)干旱模擬較為敏感，造成非編碼區(qū)的微衛(wèi)星序列的遺傳變異和分化或微衛(wèi)星不穩(wěn)定等，致使其重復(fù)次數(shù)發(fā)生相應(yīng)變化[5]，由于干旱脅迫下信號(hào)傳遞和基因表達(dá)及其調(diào)控非常復(fù)雜,對(duì)干旱敏感的基因和抗干旱基因的突變分析仍比較困難,因此，必須在此領(lǐng)域進(jìn)行深入廣泛的研究[18]。

3.3 脅迫前后聚類結(jié)果的比較

POPGENE軟件比NTSYS軟件運(yùn)行簡(jiǎn)便、快捷，且可以測(cè)多種遺傳多樣性參數(shù)，包括等位基因數(shù)，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)，Shannon’s多樣性信息指數(shù)，多態(tài)位點(diǎn)百分率，遺傳分化值，基因流等。試驗(yàn)使用兩個(gè)軟件處理遺傳多樣性參數(shù)，所得聚類結(jié)果基本一致。

基于干旱脅迫前后老芒麥的聚類結(jié)果，比較發(fā)現(xiàn)脅迫前后差異較大。有兩方面原因：(1)適應(yīng)特定生境的老芒麥對(duì)干旱模擬較為敏感，造成非編碼區(qū)的微衛(wèi)星序列的遺傳變異和分化或微衛(wèi)星不穩(wěn)定等，致使其重復(fù)次數(shù)發(fā)生相應(yīng)變化[5]；(2)由于老芒麥?zhǔn)苌硹l件的影響較大，在地理距離較小時(shí)，干旱產(chǎn)生的差異性較為突出；隨著地理距離的增大，地理位置產(chǎn)生的差異超出干旱引起的差異，這與一些學(xué)者的研究結(jié)果一致。通過研究氣候效應(yīng)對(duì)以色列二粒小麥微衛(wèi)星多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)在地理范圍較大時(shí)小氣候的選擇作用阻礙了基因漂移，從而造成較大的遺傳分化[19]。在研究歐洲鹽沼披堿草屬的種群遺傳結(jié)構(gòu)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在小地理范圍(<100 m)下，具有獨(dú)特生境的披堿草居群有很明顯的遺傳變異，超過60 km時(shí)，地理距離隔離造成的影響變?nèi)?，并總結(jié)出總遺傳變異的14%是由生境造成的，8.9%與地理距離有關(guān)[20]，進(jìn)一步肯定了生境條件對(duì)披堿草屬植物遺傳變異的影響。遺傳上的變異是物種進(jìn)化和選擇的基礎(chǔ)，在育種上的地位十分重要[21]。因此，應(yīng)采取適當(dāng)?shù)拇胧┩咨票４娌⒑侠黹_發(fā)利用。

干旱脅迫處理的20份不同居群的老芒麥遺傳多樣性豐富，多態(tài)性比例為89.565%，SSR標(biāo)記效率(MI)為3.87，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(He)為0.332 4，Shannon指數(shù)(Ho)為0.492 6。脅迫處理材料與同批材料脅迫前的聚類結(jié)果差異較大。脅迫前后UPGMA聚類都表明產(chǎn)地相同的材料大多聚為一類，但不完全一致，其中來自內(nèi)蒙古的材料脅迫前后差異較大。

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