菠菜育種材料的遺傳多樣性分析

梅燚+崔彥玲+郭軍+陳海麗+孟淑春

摘要:利用形態(tài)學分類法和AFLP分子標記技術(shù)對45份菠菜(Spinacia oleracea L.)育種材料的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進行了研究?結(jié)果表明,從256對引物中篩選出18對擴增效果較好的引物,共擴增到960個條帶,146個多態(tài)性位點,PIC值(平均多態(tài)信息量)為15.2%?AFLP標記技術(shù)的聚類分析表明,第一類群主要以歐美資源和有歐美血統(tǒng)的雜交種為主;第二類群主要以日本資源和含有日本血統(tǒng)的雜交種為主;第三類群以中國本土品種為主?從聚類結(jié)果看,與形態(tài)學的分類結(jié)果基本一致,而且聚類結(jié)果與地域來源和形態(tài)特征有一定的對應(yīng)關(guān)系?

關(guān)鍵詞:菠菜(Spinacia oleracea L.); AFLP; 遺傳多樣性;親緣關(guān)系;形態(tài)學

中圖分類號:S636.1;Q7文獻標識碼:A文章編號:0439-8114(2014)11-2561-06

The Genetic Diversity of Breeding Materials of Spinach

MEI Yi1,2,CUI Yan-ling1,GUO Jun2,CHEN Hai-li1,MENG Shu-chun1

(1.Beijing Vegetable Research Center, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops (North China)/Key Laboratory of Urban Agriculture (North), Ministry of Agriculture, Beijing 100097,China;2. Institute of Agricultural Science in Jiangsu Coastal Areas, Yancheng 224002, Jiangsu, China)

Abstract: The genetic diversity and phylogenetic relationship of 45(Spinacia oleracea L.) breeding materials of spinach were studied by traditional taxonomy and AFLP markers. The results showed that eighteen polymorphic primes pairs were screened from 256 primer pairs and 146 polymorphic bands were observed from total 960 amplified bands. The value of PIC was 15.2%. The genetic diversity of 45 spinach breeding materials with AFLP molecular markers was clustered into three groups. The first group was mainly the Europe and America varieties. The second group was mostly the Japan varieties. The third group was the Chinese varieties. The results were consisted with the traditional classification. The clusters were associated with the origins and the morphological characters of the breeding materials tested.

Key words: spinach(Spinacia oleracea L.);AFLP;genetic diversity;phylogenetic relationship; traditional taxonomy

基金項目:國家科技支撐計劃課題項目(2012BAD02B04;2012BAK26B03);北京市農(nóng)林科學院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(KJCX201202001;KJCX201101010);北京市農(nóng)林科學院青年科研基金項目(QNJJ201211);北京市科委重大課題項目(D131100000413001)

菠菜(Spinacia oleracea L.)是藜科(Chenopodiaceae)菠菜屬(Spinacia)中的一個栽培種?原產(chǎn)于伊朗,以葉片和嫩莖為食用器官,適應(yīng)性廣?耐儲藏?供應(yīng)期長?栽培方式多樣,在世界各地普遍種植,是我國主要的出口蔬菜之一?但是目前我國市場上菠菜品種混雜,研究仍相對薄弱,優(yōu)良品種材料較難獲得已經(jīng)成為菠菜育種的嚴重障礙?

關(guān)于菠菜遺傳多樣性及親緣關(guān)系的研究,近年來有一些報道,采用的方法有核型分析[1]?同工酶技術(shù)[2]?RAPD技術(shù)[3]?而使用AFLP(Amplified fragment length polymorphism)分子標記方法對菠菜進行遺傳多樣性和親緣關(guān)系的研究尚未見報道?AFLP技術(shù)于1993年由荷蘭科學家Zabeau和Vos創(chuàng)建[4],是結(jié)合了RFLP和PCR的一種技術(shù),兼具RFLP的穩(wěn)定性和PCR的高效性,目前已被廣泛應(yīng)用在物種的遺傳多樣性分析[5]?種質(zhì)資源鑒定[6]等方面?本試驗結(jié)合形態(tài)學性狀分析和AFLP技術(shù)對45份菠菜材料進行了遺傳多樣性分析,為菠菜的種質(zhì)資源收集?保存及利用提供一定的理論依據(jù)?

1材料與方法

1.1試驗材料

45份菠菜材料均由北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心菠菜育種課題組提供,2010年4月采集于北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心四季青實驗農(nóng)場?試驗材料名稱及其來源見表1?

1.2試驗方法

1.2.1菠菜種質(zhì)資源形態(tài)學調(diào)查在春?秋兩季于田間采集45份菠菜樣品,每個樣品3次重復(fù),調(diào)查菠菜田間質(zhì)量性狀,包括:株型?葉片挺直度?葉型?葉尖?葉基?葉面褶皺?葉面光澤?葉色?葉裂刻?葉柄色?抽薹期及葉厚?對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計換算,利用SPSS 11.0 軟件計算不同種群間的遺傳相似度,繪制出聚類分析樹狀圖?

1.2.2AFLP分析參照CTAB法[7]并進行改良提取菠菜的基因組DNA?基因組DNA的酶切?連接?預(yù)擴增和選擇性擴增參考文獻[8]進行了體系優(yōu)化?

利用稀有切點限制性內(nèi)切酶(6個識別位點的PstⅠ)與多切點限制性內(nèi)切酶(4個識別位點的MseⅠ)相搭配進行雙酶切?由于菠菜遺傳背景相對較寬,所以采用了P+3/M+3選擇性引物組合,引物名稱及序列見表2?

PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后利用強堿法[將凝膠放入第一個水槽中2~3 min漂洗7~8次,然后轉(zhuǎn)到0.1%硝酸銀溶液中靜置染色10 min;在第二個槽中漂洗7~8次,置于1.5%氫氧化鈉溶液中(含1%甲醛),顯影3~5 min;再放入第一個水槽中2~3 min后漂洗7~8次]進行染色,讀膠并記錄?對多態(tài)性條帶進行整理并經(jīng)NTSYS 2.10e?Structure 2.3軟件分析,建立聚類分析樹狀圖?

2結(jié)果與分析

2.1菠菜種質(zhì)資源田間性狀聚類分析

對45份菠菜種質(zhì)的形態(tài)學標記進行聚類分析,利用SPSS 11.0軟件計算出不同種群間的遺傳相似度,對數(shù)據(jù)進行聚類分析,構(gòu)建聚類分析樹狀圖(圖1)?如圖1所示,形態(tài)學標記聚類將供試的45份菠菜種質(zhì)分為3個類群?

第一類群:美2號?美2號×全能?美3號?“06-118”?丹麥1號?美2號ד98-58”?法國5號?美2號×聯(lián)?p07-22?“07-75”?強力398?荷蘭5號?“98-58”×laron?冠軍強力?全能×哈?美2號×羅?金成尖?法國6號×全能?福將?該類群的品種生物學特征為半直立株型,卵形葉型,葉面微皺,葉片有光澤且顏色為深綠色,葉面較厚,抽薹較晚?

第二類群:???ぅ??????07-p50?07-p24早熟?“07-74”?全能?“9508”×尖?沈尖葉?07-p24?07-p69?金成×哈?美2號ד9858”?07-p49???ぅ?×前衛(wèi)433?07-65?07-75??????“9507”×全能?全能ד9780”?p5?此類群的主要特征是株型為半直立,葉型為橢圓形,葉面微皺,葉色為綠色,抽薹期適中?

第三類群:西安大葉?虎耳菜?p40-1?“07-86”?大葉?哈×全能?此類群的主要特征是株型為半直立,葉面微皺,葉色為綠色,葉裂刻淺,葉片厚度較薄?

利用形態(tài)學標記方法對45份菠菜育種材料進行分類,從地理分布來看,基本上可以把不同地理分布的菠菜材料分開,以歐美品種和含有歐美血統(tǒng)的雜交種的材料聚為同一類群,以日本品種和含有日本血統(tǒng)的雜交種聚為同一類群,以中國品種和含有中國血統(tǒng)的雜交種聚為一個類群?

2.2菠菜種質(zhì)田間形狀的相關(guān)性分析

利用SPSS 11.0軟件對45份菠菜育種材料的12個田間性狀進行相關(guān)性分析?結(jié)果表明,有4組田間性狀呈極顯著負相關(guān),株型和葉型(相似系數(shù)-0.351)?株型和葉面褶皺(-0.518)?葉面挺直度和葉尖(-0.384)?葉尖和株型(-0.494)?其中負相關(guān)性最大的是株型和葉面褶皺(-0.518),即株型越開展,葉面的褶皺越多;有6組田間性狀呈極顯著正相關(guān),葉型和葉尖(0.636)?葉型和葉面光澤(0.469)?葉面褶皺和葉尖(0.542)?葉尖和葉厚(0.413)?葉面褶皺和葉厚(0.493)?葉色和抽薹期(0.413)?其中正相關(guān)性最大的是葉型和葉尖(0.636),說明葉尖很大程度上決定了葉片形狀,研究比較了各種質(zhì)量性狀之間的關(guān)聯(lián)性,為下一步研究其控制機理提供依據(jù)?

利用SPSS 11.0軟件分析了菠菜種質(zhì)田間性狀之間的關(guān)聯(lián)程度,并繪制成聚類圖?由圖2可知,菠菜的許多田間性狀關(guān)聯(lián)性很強,鑒于這些性狀,分別針對每對相關(guān)性很高的性狀設(shè)計完整的試驗,進一步證實其相關(guān)的可靠性,從分子水平上進行QTL定位,驗證其性狀的位點與田間相關(guān)性試驗結(jié)果的一致性?

2.3AFLP分析

本試驗用256對引物組合篩選出18對擴增效果較好的引物,分別是4769?4770?4776?5176?5264?5266?5268?5269?5270?5271?5276?5476?5563?5568?5569?5572?5578?5669(圖3)?用18對引物對45份菠菜種質(zhì)進行分析,共擴增出960個條帶,146個多態(tài)性位點,PIC值為15.2%?

2.4菠菜種質(zhì)AFLP分子標記聚類分析

利用NTSYS 2.10e軟件對AFLP分子標記統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行聚類分析,取遺傳相似系數(shù)為0.68時,可將45份菠菜種質(zhì)分為三大類群(圖4)?

第一類群:美3號?荷蘭5號?美2號?“07-75”?金成×哈?丹麥1號?全能×哈?美2號×全能?沈尖葉?美2號×羅?美2號×聯(lián)?福將?美2號ד98-58”?p07-22?“9507”×全能?美2號ד9858”?金成尖?“9508”×尖?????全能?法國5號?其中歐美材料有7個,日本材料有4份,中國材料有1份,雜交種有9份(其中有5個含有歐美血統(tǒng))?此類群主要以歐美材料和含有歐美血統(tǒng)的雜交種為主?主要特征為株型半直立,葉色深綠,抽薹期較晚,葉片有光澤且較厚?

第二類群:法國6號×全能?07-p24?全能ד9780”???ぅ?×前衛(wèi)433????ぅ??冠軍強力?“07-65”?07-p24早熟?“07-74”?07-p50?“98-58”×laron?07-p49?07-p69??????強力398?大葉,此類主要以日本材料和含有日本血統(tǒng)的雜交種為主,其中日本材料12份,雜交種4份(都含有日本血統(tǒng)),沒有歐美材料和中國材料?主要特征為葉片綠色,抽薹期適中,葉面微皺,葉片為橢圓形?

第三類群:p5?p40-1?虎耳菜?西安大葉?哈×全能?“07-86”?“06-118”?“07-75”?中國材料6份,日本材料1份,1個雜交種(含有中國血統(tǒng)),沒有歐美材料?此類群以中國材料為主,主要特征是葉色較淺,株型的直立性較強,抽薹比較早,葉片褶皺較少,葉片較薄?

從AFLP標記分析的結(jié)果可以看出,大多數(shù)來自同一地區(qū)或有此地區(qū)血統(tǒng)的資源聚到了一類,但還有一些例外,尤其是來自日本的品種?主要是由于育種材料中選取的日本材料比較多,所以相對于中國和歐美材料來說,多樣性豐富一點,而且日本菠菜育種一直居于世界領(lǐng)先地位,試驗所用的一些材料很可能是日本材料和其他地區(qū)材料經(jīng)過改良后得到的產(chǎn)物,所以這些材料的自交系會分到其他類群?而一些遺傳背景很相似的材料卻被分在不同的類群,可能因為它們是多代自交系,第一代的種子較雜,后代分離比較大,而且也有可能和雜交技術(shù)有關(guān)?

利用Structure 2.3軟件對45份菠菜種質(zhì)進行Q值計算,結(jié)果表明(表3),除5份材料以外,其余材料的主成分都大于0.7,最大的達到0.981,說明所選育種材料的歸屬比較明確,同一類群內(nèi)親緣關(guān)系比較近,同時樣品中還存在其他類的成分,但其含量較少,說明類與類之間的親緣關(guān)系比較遠?

3討論

利用AFLP分子標記的方法,對256對P+3/M+3引物組合進行篩選,選出18對多態(tài)性較高,且條帶清晰的引物組合?這18對引物組合共獲得960條清晰可辨的條帶,其中有146個多態(tài)性位點,平均多態(tài)信息量為15.2%,最終把45份菠菜種質(zhì)材料分為三類?分別是歐美類群?日本類群?中國類群,根據(jù)Structure 2.3軟件計算Q值,可以得出中國類群和日本類群親緣關(guān)系較近,與歐美類群親緣關(guān)系較遠?

同時通過統(tǒng)計12個田間性狀,利用形態(tài)學分類的方法也把種質(zhì)材料分為三類,并且兩種分類方法的結(jié)果有70%左右是吻合的,45份材料中分類不一致的有14個樣品?說明傳統(tǒng)的形態(tài)學性狀分類和現(xiàn)代分子標記分類在結(jié)論上比較一致,但是由于兩種分類方法基于的原理不同,其分析結(jié)果就不會完全一致?田間性狀是根據(jù)植株外形上和品質(zhì)上的差異對其分類,優(yōu)點是簡單?有效?實用?費用較低?缺點是容易受外界環(huán)境條件和人為主觀判斷等因素的影響,此方法適用于粗略的分類?AFLP分子標記是從DNA水平上直接根據(jù)基因的差異來分類,其優(yōu)點是準確?不受外界環(huán)境和人為主觀判斷的影響,缺點是費用較高?耗時較長?難度較大,但可以對親緣關(guān)系較近的材料進行較為準確的遺傳分析?所以兩種方法各有所長,要根據(jù)材料的具體情況決定使用的方法?

本研究在DNA分子水平上證明了我國菠菜種質(zhì)具有較廣泛的遺傳背景,從而為菠菜屬種質(zhì)資源開發(fā)利用以及新品種的選育提供了參考?

參考文獻:

[1] LAN T, ZHANG S, LIU B, et a1.Differentiating sex chromosomes of the dioecious Spinacia oleracea L.(spinach)by FISH of 45S rDNA[J].Cytogenet Genome Res,2006,114(2):175-177.

[2] 高武軍,肖理會,盧龍斗,等.菠菜的性別相關(guān)同工酶標記分析[J].河南師范大學學報(自然科學版),2006,34(4):147-150.

[3] 楊金華,鄧傳良,張準超,等.菠菜性別相關(guān)RAPD分子標記體系的建立與優(yōu)化[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2009(2):40-42.

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[8] 梅燚,侯雷平,孟淑春,等.菠菜AFLP反應(yīng)體系初探[J].華北農(nóng)學報,2010,25(4):111-115.

2結(jié)果與分析

2.1菠菜種質(zhì)資源田間性狀聚類分析

對45份菠菜種質(zhì)的形態(tài)學標記進行聚類分析,利用SPSS 11.0軟件計算出不同種群間的遺傳相似度,對數(shù)據(jù)進行聚類分析,構(gòu)建聚類分析樹狀圖(圖1)?如圖1所示,形態(tài)學標記聚類將供試的45份菠菜種質(zhì)分為3個類群?

第一類群:美2號?美2號×全能?美3號?“06-118”?丹麥1號?美2號ד98-58”?法國5號?美2號×聯(lián)?p07-22?“07-75”?強力398?荷蘭5號?“98-58”×laron?冠軍強力?全能×哈?美2號×羅?金成尖?法國6號×全能?福將?該類群的品種生物學特征為半直立株型,卵形葉型,葉面微皺,葉片有光澤且顏色為深綠色,葉面較厚,抽薹較晚?

第二類群:???ぅ??????07-p50?07-p24早熟?“07-74”?全能?“9508”×尖?沈尖葉?07-p24?07-p69?金成×哈?美2號ד9858”?07-p49???ぅ?×前衛(wèi)433?07-65?07-75??????“9507”×全能?全能ד9780”?p5?此類群的主要特征是株型為半直立,葉型為橢圓形,葉面微皺,葉色為綠色,抽薹期適中?

第三類群:西安大葉?虎耳菜?p40-1?“07-86”?大葉?哈×全能?此類群的主要特征是株型為半直立,葉面微皺,葉色為綠色,葉裂刻淺,葉片厚度較薄?

利用形態(tài)學標記方法對45份菠菜育種材料進行分類,從地理分布來看,基本上可以把不同地理分布的菠菜材料分開,以歐美品種和含有歐美血統(tǒng)的雜交種的材料聚為同一類群,以日本品種和含有日本血統(tǒng)的雜交種聚為同一類群,以中國品種和含有中國血統(tǒng)的雜交種聚為一個類群?

2.2菠菜種質(zhì)田間形狀的相關(guān)性分析

利用SPSS 11.0軟件對45份菠菜育種材料的12個田間性狀進行相關(guān)性分析?結(jié)果表明,有4組田間性狀呈極顯著負相關(guān),株型和葉型(相似系數(shù)-0.351)?株型和葉面褶皺(-0.518)?葉面挺直度和葉尖(-0.384)?葉尖和株型(-0.494)?其中負相關(guān)性最大的是株型和葉面褶皺(-0.518),即株型越開展,葉面的褶皺越多;有6組田間性狀呈極顯著正相關(guān),葉型和葉尖(0.636)?葉型和葉面光澤(0.469)?葉面褶皺和葉尖(0.542)?葉尖和葉厚(0.413)?葉面褶皺和葉厚(0.493)?葉色和抽薹期(0.413)?其中正相關(guān)性最大的是葉型和葉尖(0.636),說明葉尖很大程度上決定了葉片形狀,研究比較了各種質(zhì)量性狀之間的關(guān)聯(lián)性,為下一步研究其控制機理提供依據(jù)?

利用SPSS 11.0軟件分析了菠菜種質(zhì)田間性狀之間的關(guān)聯(lián)程度,并繪制成聚類圖?由圖2可知,菠菜的許多田間性狀關(guān)聯(lián)性很強,鑒于這些性狀,分別針對每對相關(guān)性很高的性狀設(shè)計完整的試驗,進一步證實其相關(guān)的可靠性,從分子水平上進行QTL定位,驗證其性狀的位點與田間相關(guān)性試驗結(jié)果的一致性?

2.3AFLP分析

本試驗用256對引物組合篩選出18對擴增效果較好的引物,分別是4769?4770?4776?5176?5264?5266?5268?5269?5270?5271?5276?5476?5563?5568?5569?5572?5578?5669(圖3)?用18對引物對45份菠菜種質(zhì)進行分析,共擴增出960個條帶,146個多態(tài)性位點,PIC值為15.2%?

2.4菠菜種質(zhì)AFLP分子標記聚類分析

利用NTSYS 2.10e軟件對AFLP分子標記統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行聚類分析,取遺傳相似系數(shù)為0.68時,可將45份菠菜種質(zhì)分為三大類群(圖4)?

第一類群:美3號?荷蘭5號?美2號?“07-75”?金成×哈?丹麥1號?全能×哈?美2號×全能?沈尖葉?美2號×羅?美2號×聯(lián)?福將?美2號ד98-58”?p07-22?“9507”×全能?美2號ד9858”?金成尖?“9508”×尖?????全能?法國5號?其中歐美材料有7個,日本材料有4份,中國材料有1份,雜交種有9份(其中有5個含有歐美血統(tǒng))?此類群主要以歐美材料和含有歐美血統(tǒng)的雜交種為主?主要特征為株型半直立,葉色深綠,抽薹期較晚,葉片有光澤且較厚?

第二類群:法國6號×全能?07-p24?全能ד9780”???ぅ?×前衛(wèi)433????ぅ??冠軍強力?“07-65”?07-p24早熟?“07-74”?07-p50?“98-58”×laron?07-p49?07-p69??????強力398?大葉,此類主要以日本材料和含有日本血統(tǒng)的雜交種為主,其中日本材料12份,雜交種4份(都含有日本血統(tǒng)),沒有歐美材料和中國材料?主要特征為葉片綠色,抽薹期適中,葉面微皺,葉片為橢圓形?

第三類群:p5?p40-1?虎耳菜?西安大葉?哈×全能?“07-86”?“06-118”?“07-75”?中國材料6份,日本材料1份,1個雜交種(含有中國血統(tǒng)),沒有歐美材料?此類群以中國材料為主,主要特征是葉色較淺,株型的直立性較強,抽薹比較早,葉片褶皺較少,葉片較薄?

從AFLP標記分析的結(jié)果可以看出,大多數(shù)來自同一地區(qū)或有此地區(qū)血統(tǒng)的資源聚到了一類,但還有一些例外,尤其是來自日本的品種?主要是由于育種材料中選取的日本材料比較多,所以相對于中國和歐美材料來說,多樣性豐富一點,而且日本菠菜育種一直居于世界領(lǐng)先地位,試驗所用的一些材料很可能是日本材料和其他地區(qū)材料經(jīng)過改良后得到的產(chǎn)物,所以這些材料的自交系會分到其他類群?而一些遺傳背景很相似的材料卻被分在不同的類群,可能因為它們是多代自交系,第一代的種子較雜,后代分離比較大,而且也有可能和雜交技術(shù)有關(guān)?

利用Structure 2.3軟件對45份菠菜種質(zhì)進行Q值計算,結(jié)果表明(表3),除5份材料以外,其余材料的主成分都大于0.7,最大的達到0.981,說明所選育種材料的歸屬比較明確,同一類群內(nèi)親緣關(guān)系比較近,同時樣品中還存在其他類的成分,但其含量較少,說明類與類之間的親緣關(guān)系比較遠?

3討論

利用AFLP分子標記的方法,對256對P+3/M+3引物組合進行篩選,選出18對多態(tài)性較高,且條帶清晰的引物組合?這18對引物組合共獲得960條清晰可辨的條帶,其中有146個多態(tài)性位點,平均多態(tài)信息量為15.2%,最終把45份菠菜種質(zhì)材料分為三類?分別是歐美類群?日本類群?中國類群,根據(jù)Structure 2.3軟件計算Q值,可以得出中國類群和日本類群親緣關(guān)系較近,與歐美類群親緣關(guān)系較遠?

同時通過統(tǒng)計12個田間性狀,利用形態(tài)學分類的方法也把種質(zhì)材料分為三類,并且兩種分類方法的結(jié)果有70%左右是吻合的,45份材料中分類不一致的有14個樣品?說明傳統(tǒng)的形態(tài)學性狀分類和現(xiàn)代分子標記分類在結(jié)論上比較一致,但是由于兩種分類方法基于的原理不同,其分析結(jié)果就不會完全一致?田間性狀是根據(jù)植株外形上和品質(zhì)上的差異對其分類,優(yōu)點是簡單?有效?實用?費用較低?缺點是容易受外界環(huán)境條件和人為主觀判斷等因素的影響,此方法適用于粗略的分類?AFLP分子標記是從DNA水平上直接根據(jù)基因的差異來分類,其優(yōu)點是準確?不受外界環(huán)境和人為主觀判斷的影響,缺點是費用較高?耗時較長?難度較大,但可以對親緣關(guān)系較近的材料進行較為準確的遺傳分析?所以兩種方法各有所長,要根據(jù)材料的具體情況決定使用的方法?

本研究在DNA分子水平上證明了我國菠菜種質(zhì)具有較廣泛的遺傳背景,從而為菠菜屬種質(zhì)資源開發(fā)利用以及新品種的選育提供了參考?

參考文獻:

[1] LAN T, ZHANG S, LIU B, et a1.Differentiating sex chromosomes of the dioecious Spinacia oleracea L.(spinach)by FISH of 45S rDNA[J].Cytogenet Genome Res,2006,114(2):175-177.

[2] 高武軍,肖理會,盧龍斗,等.菠菜的性別相關(guān)同工酶標記分析[J].河南師范大學學報(自然科學版),2006,34(4):147-150.

[3] 楊金華,鄧傳良,張準超,等.菠菜性別相關(guān)RAPD分子標記體系的建立與優(yōu)化[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2009(2):40-42.

[4] 王和勇,陳敏,廖志華,等. RFLP?RAPD?AFLP分子標記及其在植物生物技術(shù)中的應(yīng)用[J].生物學雜志,1999,16(4):24-25.

[5] 徐志紅, 徐永陽, 劉君璞,等.甜瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究[J].果樹學報, 2008, 25(4):552-558.

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[7] PATERSON A H, LANDER E S, HEWITT J D, et al. Resolution of quantitative traits into Mendelian factors by using a complete linkage map of restriction fragment length polymorphism[J]. Nature, 1998, 335:721-726.

[8] 梅燚,侯雷平,孟淑春,等.菠菜AFLP反應(yīng)體系初探[J].華北農(nóng)學報,2010,25(4):111-115.

2結(jié)果與分析

2.1菠菜種質(zhì)資源田間性狀聚類分析

對45份菠菜種質(zhì)的形態(tài)學標記進行聚類分析,利用SPSS 11.0軟件計算出不同種群間的遺傳相似度,對數(shù)據(jù)進行聚類分析,構(gòu)建聚類分析樹狀圖(圖1)?如圖1所示,形態(tài)學標記聚類將供試的45份菠菜種質(zhì)分為3個類群?

第一類群:美2號?美2號×全能?美3號?“06-118”?丹麥1號?美2號ד98-58”?法國5號?美2號×聯(lián)?p07-22?“07-75”?強力398?荷蘭5號?“98-58”×laron?冠軍強力?全能×哈?美2號×羅?金成尖?法國6號×全能?福將?該類群的品種生物學特征為半直立株型,卵形葉型,葉面微皺,葉片有光澤且顏色為深綠色,葉面較厚,抽薹較晚?

第二類群:???ぅ??????07-p50?07-p24早熟?“07-74”?全能?“9508”×尖?沈尖葉?07-p24?07-p69?金成×哈?美2號ד9858”?07-p49???ぅ?×前衛(wèi)433?07-65?07-75??????“9507”×全能?全能ד9780”?p5?此類群的主要特征是株型為半直立,葉型為橢圓形,葉面微皺,葉色為綠色,抽薹期適中?

第三類群:西安大葉?虎耳菜?p40-1?“07-86”?大葉?哈×全能?此類群的主要特征是株型為半直立,葉面微皺,葉色為綠色,葉裂刻淺,葉片厚度較薄?

利用形態(tài)學標記方法對45份菠菜育種材料進行分類,從地理分布來看,基本上可以把不同地理分布的菠菜材料分開,以歐美品種和含有歐美血統(tǒng)的雜交種的材料聚為同一類群,以日本品種和含有日本血統(tǒng)的雜交種聚為同一類群,以中國品種和含有中國血統(tǒng)的雜交種聚為一個類群?

2.2菠菜種質(zhì)田間形狀的相關(guān)性分析

利用SPSS 11.0軟件對45份菠菜育種材料的12個田間性狀進行相關(guān)性分析?結(jié)果表明,有4組田間性狀呈極顯著負相關(guān),株型和葉型(相似系數(shù)-0.351)?株型和葉面褶皺(-0.518)?葉面挺直度和葉尖(-0.384)?葉尖和株型(-0.494)?其中負相關(guān)性最大的是株型和葉面褶皺(-0.518),即株型越開展,葉面的褶皺越多;有6組田間性狀呈極顯著正相關(guān),葉型和葉尖(0.636)?葉型和葉面光澤(0.469)?葉面褶皺和葉尖(0.542)?葉尖和葉厚(0.413)?葉面褶皺和葉厚(0.493)?葉色和抽薹期(0.413)?其中正相關(guān)性最大的是葉型和葉尖(0.636),說明葉尖很大程度上決定了葉片形狀,研究比較了各種質(zhì)量性狀之間的關(guān)聯(lián)性,為下一步研究其控制機理提供依據(jù)?

利用SPSS 11.0軟件分析了菠菜種質(zhì)田間性狀之間的關(guān)聯(lián)程度,并繪制成聚類圖?由圖2可知,菠菜的許多田間性狀關(guān)聯(lián)性很強,鑒于這些性狀,分別針對每對相關(guān)性很高的性狀設(shè)計完整的試驗,進一步證實其相關(guān)的可靠性,從分子水平上進行QTL定位,驗證其性狀的位點與田間相關(guān)性試驗結(jié)果的一致性?

2.3AFLP分析

本試驗用256對引物組合篩選出18對擴增效果較好的引物,分別是4769?4770?4776?5176?5264?5266?5268?5269?5270?5271?5276?5476?5563?5568?5569?5572?5578?5669(圖3)?用18對引物對45份菠菜種質(zhì)進行分析,共擴增出960個條帶,146個多態(tài)性位點,PIC值為15.2%?

2.4菠菜種質(zhì)AFLP分子標記聚類分析

利用NTSYS 2.10e軟件對AFLP分子標記統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行聚類分析,取遺傳相似系數(shù)為0.68時,可將45份菠菜種質(zhì)分為三大類群(圖4)?

第一類群:美3號?荷蘭5號?美2號?“07-75”?金成×哈?丹麥1號?全能×哈?美2號×全能?沈尖葉?美2號×羅?美2號×聯(lián)?福將?美2號ד98-58”?p07-22?“9507”×全能?美2號ד9858”?金成尖?“9508”×尖?????全能?法國5號?其中歐美材料有7個,日本材料有4份,中國材料有1份,雜交種有9份(其中有5個含有歐美血統(tǒng))?此類群主要以歐美材料和含有歐美血統(tǒng)的雜交種為主?主要特征為株型半直立,葉色深綠,抽薹期較晚,葉片有光澤且較厚?

第二類群:法國6號×全能?07-p24?全能ד9780”???ぅ?×前衛(wèi)433????ぅ??冠軍強力?“07-65”?07-p24早熟?“07-74”?07-p50?“98-58”×laron?07-p49?07-p69??????強力398?大葉,此類主要以日本材料和含有日本血統(tǒng)的雜交種為主,其中日本材料12份,雜交種4份(都含有日本血統(tǒng)),沒有歐美材料和中國材料?主要特征為葉片綠色,抽薹期適中,葉面微皺,葉片為橢圓形?

第三類群:p5?p40-1?虎耳菜?西安大葉?哈×全能?“07-86”?“06-118”?“07-75”?中國材料6份,日本材料1份,1個雜交種(含有中國血統(tǒng)),沒有歐美材料?此類群以中國材料為主,主要特征是葉色較淺,株型的直立性較強,抽薹比較早,葉片褶皺較少,葉片較薄?

從AFLP標記分析的結(jié)果可以看出,大多數(shù)來自同一地區(qū)或有此地區(qū)血統(tǒng)的資源聚到了一類,但還有一些例外,尤其是來自日本的品種?主要是由于育種材料中選取的日本材料比較多,所以相對于中國和歐美材料來說,多樣性豐富一點,而且日本菠菜育種一直居于世界領(lǐng)先地位,試驗所用的一些材料很可能是日本材料和其他地區(qū)材料經(jīng)過改良后得到的產(chǎn)物,所以這些材料的自交系會分到其他類群?而一些遺傳背景很相似的材料卻被分在不同的類群,可能因為它們是多代自交系,第一代的種子較雜,后代分離比較大,而且也有可能和雜交技術(shù)有關(guān)?

利用Structure 2.3軟件對45份菠菜種質(zhì)進行Q值計算,結(jié)果表明(表3),除5份材料以外,其余材料的主成分都大于0.7,最大的達到0.981,說明所選育種材料的歸屬比較明確,同一類群內(nèi)親緣關(guān)系比較近,同時樣品中還存在其他類的成分,但其含量較少,說明類與類之間的親緣關(guān)系比較遠?

3討論

利用AFLP分子標記的方法,對256對P+3/M+3引物組合進行篩選,選出18對多態(tài)性較高,且條帶清晰的引物組合?這18對引物組合共獲得960條清晰可辨的條帶,其中有146個多態(tài)性位點,平均多態(tài)信息量為15.2%,最終把45份菠菜種質(zhì)材料分為三類?分別是歐美類群?日本類群?中國類群,根據(jù)Structure 2.3軟件計算Q值,可以得出中國類群和日本類群親緣關(guān)系較近,與歐美類群親緣關(guān)系較遠?

同時通過統(tǒng)計12個田間性狀,利用形態(tài)學分類的方法也把種質(zhì)材料分為三類,并且兩種分類方法的結(jié)果有70%左右是吻合的,45份材料中分類不一致的有14個樣品?說明傳統(tǒng)的形態(tài)學性狀分類和現(xiàn)代分子標記分類在結(jié)論上比較一致,但是由于兩種分類方法基于的原理不同,其分析結(jié)果就不會完全一致?田間性狀是根據(jù)植株外形上和品質(zhì)上的差異對其分類,優(yōu)點是簡單?有效?實用?費用較低?缺點是容易受外界環(huán)境條件和人為主觀判斷等因素的影響,此方法適用于粗略的分類?AFLP分子標記是從DNA水平上直接根據(jù)基因的差異來分類,其優(yōu)點是準確?不受外界環(huán)境和人為主觀判斷的影響,缺點是費用較高?耗時較長?難度較大,但可以對親緣關(guān)系較近的材料進行較為準確的遺傳分析?所以兩種方法各有所長,要根據(jù)材料的具體情況決定使用的方法?

本研究在DNA分子水平上證明了我國菠菜種質(zhì)具有較廣泛的遺傳背景,從而為菠菜屬種質(zhì)資源開發(fā)利用以及新品種的選育提供了參考?

參考文獻:

[1] LAN T, ZHANG S, LIU B, et a1.Differentiating sex chromosomes of the dioecious Spinacia oleracea L.(spinach)by FISH of 45S rDNA[J].Cytogenet Genome Res,2006,114(2):175-177.

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