黃芪甲苷對急性肺損傷大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)影響

遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院胸外科，遼寧 錦州 121000

黃芪甲苷對急性肺損傷大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)影響

張吉臧東鈺

遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院胸外科，遼寧 錦州 121000

目的探討黃芪甲苷(ASIV)對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)急性肺損傷(ALI)的保護作用，并初步探討其抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細胞凋亡的作用。方法隨機將50只SD大鼠分成5組，每組10只。對照組(靜注生理鹽水1mg/kg)，ALI組(靜注LPS，5mg/kg)，ASIV組(注射LPS前，給藥3、6、12mg/kg ASIV連續(xù)灌胃7天)。觀察注射12h后肺組織濕干重(W/D)、western blotting檢測葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(CHOP)的蛋白表達。結(jié)果ALI組W/D值較對照組上升(P<0.01)，GRP78、ChOP蛋白表達較對照組升高(P<0.01)；ASIV組W/D值較ALI組下降(P<0.01)，GRP78、ChOP蛋白表達較ALI組降低(P<0.01)，并呈一定的劑量依賴性。結(jié)論黃芪甲苷對急性肺損傷大鼠有保護作用，其作用機制可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。

黃芪甲苷; 急性肺損傷; 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激; 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)；C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(CHOP)

嚴重的創(chuàng)傷、外傷及大手術(shù)易并發(fā)有革蘭陰性菌感染所產(chǎn)生的內(nèi)毒素血癥，肺部是最易受累的器官，容易引發(fā)急性肺損傷(actue lung injury，ALI)，進一步發(fā)展可致急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，甚至多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)[1]。革蘭陰性細菌內(nèi)毒素的主要成分脂多糖(LPS)具有明顯的致ALI作用。已證實在LPS引起肺的急性炎癥反應(yīng)中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是內(nèi)毒素源性的急性肺損傷的重要病理生理機制[2]。中藥黃芪(astragalus,As) 為豆科植物蒙古黃芪或莢膜黃芪的干燥根，味甘、性溫、乃補氣之圣藥。黃芪甲苷(Astragaloside IV，ASIV)為黃芪的有效成分之一，對ALI具有治療作用[3]，但治療ALI的作用機制尚不清楚。本研究通過觀察ASIV干預(yù)對ALI大鼠肺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，進一步明確黃芪甲苷對ALI的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 50只SD大鼠250～300g，雌雄不拘，由遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。主要試劑有黃芪甲苷(上海源葉生物科技有限公司，經(jīng)高效液相色譜法鑒定純度為98%，批號：CM0308QA13)，內(nèi)毒素LPS(美國Sigma公司，批號：L2880)，組織蛋白提取試劑盒(南京碧云天公司，批號：P0013B)，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78 ，批號：ab21685)、C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(CHOP，批號：ab11419)和β-actin(美國Santa Cruz公司，批號：sc-47778)，其他均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 動物分組及模型制備 50只健康SD大鼠隨機分成5組，每組10只。對照組(靜注生理鹽水1mg/kg)，ALI組(靜注LPS，5mg/kg)，ASIV高、中、低劑量組(注射LPS前，給藥3、6、12mg/kg ASIV連續(xù)灌胃7d)。各組動物取樣前禁食12h，20%烏拉坦(12g/kg)腹腔注射麻醉。開胸取右前葉組織做濕干重(W/D)測定；取右肺副葉、后葉置于生理鹽水中迅速漂洗干凈后，立即放入液氮中冷凍，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱內(nèi)保存，用作western blotting檢測。

1.3 指標測定

1.3.1 肺組織作濕干重(W/D)測定 取右前葉組織測定濕重量(wet weight，W)后，至干燥箱(80℃,24h)烤至恒重，測干質(zhì)量(dry weight，D)，計算肺濕干重比值。以W/D表示肺組織含水量。

1.3.2 western blotting法測定GRP78、CHOP蛋白表達 -80℃冰箱取出凍存的肺組織標本100mg加入200ml裂解液中剪碎后移入1.5ml EP管中，4℃超聲粉碎，12000r/min離心30min，取上清液用于蛋白定量。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠電壓80V，分離膠電壓120V，半干法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，恒壓電泳95V，室溫1h，4℃封閉過夜。將膜放入Ⅰ抗(1∶500稀釋)，雜交2h，封閉漂洗后將膜放入加入堿性磷酸酶標記的Ⅱ抗中(二抗均1∶500稀釋)，室溫孵育1～2 h，漂洗后加顯色劑，避光顯色2～5min，條帶出現(xiàn)，終止反應(yīng)。以β-actin為內(nèi)參照進行半定量灰度分析，以灰度比值表示蛋白表達強度。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷對肺組織W/D比值的影響 ALI組肺W/D顯著高于對照組(P﹤0.01)，ASIV組肺W/D較ALI組顯著降低(P﹤0.01)。見表1。

表1 各組大鼠肺組織W/D比值比較

注：與ALI組比較：**P<0.01。

2.2 黃芪甲苷對大鼠肺組織GRP78和CHOP蛋白表達影響 與對照組比較，ALI組大鼠GRP78和CHOP蛋白表達均升高(P<0.01)；與ALI組比較，ASIV組大鼠GRP78和CHOP蛋白表達均降低(P<0.05，P<0.01) ，且呈一定的劑量依賴性。(表2，圖1)

表2 各組大鼠肺組織GRP78 和CHOP 蛋白表達比較

注：與ALI組比較：＊P<0.05，**P<0.01。

3 討論

急性肺損傷發(fā)病急而嚴重，發(fā)病率和死亡率都較高，盡管對其機制和治療研究較多，但無有效手段治療，亦無特效藥。脂多糖是革蘭氏陰性細菌細胞壁中的一種成分，能夠?qū)C體造成廣泛的損害和影響。當(dāng)病灶或血液中革蘭氏陰性病原菌大量死亡，釋放出來的大量內(nèi)毒素進入血液時，能夠激活多種細胞釋放炎癥因子，如TNF-α、IL-1、IL-6等引起全身炎癥反應(yīng)，引起內(nèi)毒素血癥。感染、創(chuàng)傷等急性打擊及伴隨的失血、低氧、缺血再灌注損傷等多種ALI誘發(fā)因素引起組織細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能狀態(tài)的改變產(chǎn)生ERS的活化因素[1,2,4]。適量的ERS可保護細胞，但過強或持續(xù)時間過長會誘導(dǎo)細胞凋亡。GRP78是ERS的經(jīng)典標志。在健康大鼠體內(nèi)，沒有或者偶見GRP78蛋白大量表達并啟動ERS；持續(xù)過量的ERS可激活CHOP，并大量表達，最終啟動細胞凋亡途徑[5]。

中藥黃芪為一味傳統(tǒng)的補氣藥，含多種生物活性物質(zhì)，大量臨床和動物研究證實，黃芪對肺部疾病有良好的治療作用。黃芪甲苷是黃芪中主要活性成分，研究表明黃芪甲苷對急性肺損傷有保護作用[3]。本研究結(jié)果顯示，ALI組GRP78和CHOP蛋白表達量增多，經(jīng)ASIV干預(yù)后GRP78和CHOP蛋白表達量降低，提示黃芪甲苷可能通過抑制GRP78和CHOP蛋白表達，改善急性肺損傷狀態(tài)。

[1]Wheeler AP, Bernard GR. Acute lung injury and the acute respiratory distress syndrome: a clinical review[J]. Lancet, 2007, 369(9572): 1553-1564.

[2]嚴一核, 孫雪東, 邢海波, 等. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在大鼠急性肺損傷中的意義[J].中華危重癥醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 6(1): 21-26.

[3]趙建軍, 張建勇, 陳玲. 黃芪甲苷對急性肺損傷大鼠肺水通道蛋白5表達的影響[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2013, 33(5):385-389.

[4]Shore GC, Papa FR, Oakes SA. Signaling cell death from the endoplasmic reticulum stress response[J].CurrOpin Cell Biol, 2011, 23(2):143-149.

[5]李瑞芳, 王國賢, 康雅萍. α-硫辛酸對糖尿病大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)影響[J].中國公共衛(wèi)生雜志, 2013, 29(3): 390-392.

EffectofAstragalosideIVonendoplasmicreticulumstressinaratmodelofacutelunginjury

ZHANG Ji,ZANG Dong-yu

(Department of Thoracic Surgery, Affiliated Third Hospital, Liao ning medical college, Jin zhou 121000, China)

ObjectiveTo explore the effect of Astragaloside IV on apoptosis mediated by endouplasmic reticulum stress (ERS) in a rat model of acute lung injury (ALI) induced by lipopolysaccharide (LPS).MethodsFifty SD rats were randomly divided into control group, ALI group, and ASIV group, 10 in each group. The rats in the control group were treated with normal saline. The rats in the ALI group were treated with LPS (5mg/kg). The rats in the ASIV groups were pretreated with ASIV (3, 6, 12mg/kg) for 7days. After 12h injection, the change of wet-dry weight (W/D) were determined. The expressions of glucose-regulated protein 78 (GRP78) and C/EBP homologous protein (CHOP) were determined by Western blot.ResultsCompar2ed with the control group, the W/D was increased (P﹤0.01), the expression of GRP78 and CHOP were increased in the ALI group (P﹤0.01). Compared with ALI group, the W/D was decreased (P﹤0.01), the expression of GRP78 and CHOP were decreased in the ASIV groups (P﹤0.01).ConclusionAstragaloside IV has a protective effect on LPS-induced acute lung injury, which is partially via endouplasmic reticulum stress.

Astragaloside IV; acute lung injury; endouplasmic reticulum stress; glucose-regulated protein 78 (GRP78); C/EBP homologous protein (CHOP)

R285.5

A

1007-8517(2014)15-0019-02

2014.06.24)