HPLC法測定清熱涼血軟膏中大黃素、大黃酚的含量

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，浙江 杭州 310006

HPLC法測定清熱涼血軟膏中大黃素、大黃酚的含量

丁科呂焰朱濤

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，浙江 杭州 310006

目的建立清熱涼血軟膏中大黃素、大黃酚的含量測定方法。方法高效液相色譜法。色譜柱：Dionex Ultimate 3000-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸(80∶20)；檢測波長：254nm；流速：1.0ml/min。結(jié)果大黃素在0.010～0.200μg/ml范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為Y=59.069X+0.0301(r=0.9999)，平均加樣回收率為100.33%，RSD為1.743% (n=5)；大黃酚在0.020～0.400μg/ml范圍內(nèi)線形良好，回歸方程為Y=88.598X+0.1158(r=0.9999)，平均加樣回收率為100.253%，RSD為1.942% (n=5)。結(jié)論本方法操作簡便快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可以用于清熱涼血軟膏的質(zhì)量控制。

清熱涼血軟膏；大黃素；大黃酚；高效液相色譜法

清熱涼血軟膏(以下簡稱“清涼膏”)主要由大黃、當(dāng)、紫草等中藥組成，具有清熱解毒、消腫止痛、活血散淤等功效，臨床適用于跌打損傷，關(guān)節(jié)腫痛，丹毒皰疹，特異性炎癥等病癥，是浙江省中醫(yī)院傳統(tǒng)中藥軟膏(浙準(zhǔn)制字20100233)。清涼膏前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)，含有大黃成分的制劑比未含有大黃成分的中間體要產(chǎn)生更加明顯的藥理活性，故本文對清涼膏采用高效液相色譜法，測定其中主要成分大黃素、大黃酚的含量，并建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的質(zhì)量檢測方法，并為以后制劑改良研發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 儀器與試劑

Inertsil ODS-SP高效液相色譜系統(tǒng)(美國Thermo Fisher)；KQ-500DB超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；IKA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/DLSB-5低溫冷卻循環(huán)泵(德國Digital)。大黃素(批號：110756-201110)、大黃酚對照品(批號：110796-201118)均由中國藥品生物制品檢定所提供；清熱涼血軟膏(批號：121217，130109，130110，1320226，130305，浙江省中醫(yī)院)。甲醇(色譜純，美國Tedia)；重蒸水；其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱：Dionex Ultimate 3000-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸(80∶20)；檢測波長：254nm；流速：1.0ml/min；柱溫 25℃；進(jìn)樣量10μl。在本實(shí)驗(yàn)條件下，大黃素、大黃酚與其他組分分離完全，分離度R>1.5，理論塔板數(shù)以大黃素峰計(jì)不低于5000。

2.2 樣品制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取大黃素、大黃酚對照品適量，加甲醇分別制成每1ml含大黃酸、大黃素各30μg；分別精密量取大黃素對照品溶液1ml，大黃酚對照品溶液2ml，混勻，即得(每1ml含大黃素10μg，大黃酚20μg)混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的清熱涼血軟膏2g，置50ml錐形瓶中，加入甲醇25ml稱定重量，加熱回流30min，放冷，冷水浴冷卻并用甲醇補(bǔ)足減失重量；精密量取濾液5mL置50ml錐形瓶中，揮去甲醇，加2.5mol/l硫酸溶液10ml，超聲處理5min,再加氯仿10ml加熱回流1h，置分液漏斗，并用少量氯仿洗滌，并入分液漏斗，酸液用氯仿提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，減壓揮發(fā)溶劑至干，取殘?jiān)芗蛹状?0ml，溶解，取續(xù)濾液得供試品溶液。

2.2.3 缺大黃陰性對照溶液的制備 取未加入大黃粉前的清涼膏中間體，按供試品溶液的制備方法制成缺大黃陰性對照品溶液。

2.3 前處理工藝的考察 分別考察加熱回流和超聲震蕩兩種提取方法，兩者所測結(jié)果接近，加熱回流法操作簡便耗時(shí)長，超聲提取耗時(shí)短對儀器操作要求較高；考察提取時(shí)間因素的影響，20min、30min、1h、2h提取后測定結(jié)果，其中30min處理后測定結(jié)果開始穩(wěn)定；對同批樣品以常溫，加熱，冰水浴冷卻[1、2]進(jìn)行提取處理，發(fā)現(xiàn)以冰水浴處理后含量測定明顯高于其他方法，且結(jié)果重復(fù)性較好；本文參考《中國藥典》2010版(一部)大黃藥材測定的流動(dòng)相體系[3]，在流動(dòng)相中添加少量酸可以使色譜峰基線分離并峰形對稱，考察了鹽酸和硫酸并通過調(diào)整流動(dòng)相的配比，使大黃素、大黃酚的分離度、拖尾因子等符合系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)的要求，最終確定最佳流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸(80∶20)，以2.5mol/l硫酸溶液為酸性添加劑[4]。

2.4 空白試驗(yàn) 取大黃素、大黃酚對照品溶液、清涼膏供試品溶液及缺大黃的陰性對照品溶液，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣10μl(圖1)。結(jié)果表明：對照品溶液和清涼膏供試品溶液色譜圖在保留時(shí)間10、15min出現(xiàn)大黃素、大黃酚的色譜峰；缺大黃陰性對照品溶液色譜圖在相同保留時(shí)間無色譜峰，說明其他成分對測定無干擾。

2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取大黃素、大黃酚混合對照溶液(每1ml含大黃素10μg，大黃酚20μg)，吸取1，3，10，15，20μl注入高效液相色譜儀，在254nm測定大黃素、大黃酚的峰面積。以對照品量X(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：大黃素Y=59.069X+0.0301(r=0.9999)，大黃素Y=88.598X+0.1158(r=0.9999)，結(jié)果表明大黃素在0.010～0.200μg/ml、大黃酚在0.020～0.400μg/ml呈良好線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密稱取混合對照品溶液10μl，按上述色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次測量峰值，結(jié)果大黃素、大黃酚峰面積的RSD分別為1.21%和0.10%，表明精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一批號供試品溶液(130110)，按上述供試溶液測定方法，分別于0，1，2，4，12小時(shí)進(jìn)樣10μl測定，結(jié)果大黃素、大黃酚峰面積的RSD分別為2.25%、0.13%，表明樣品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號清涼膏(130110)5份，按上述供試溶液制備和測定方法，進(jìn)樣 10μl測定，結(jié)果顯示大黃素的平均含量為0.0282mg/g，RSD為1.91%；大黃酚的平均含量為0.0788mg/g，RSD為2.16%，表明重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的清涼膏樣品1.0g(批號130110)，分別加入每1ml含大黃素10μg、大黃酚20μg的對照品溶液15ml，按上述供試溶液制備和測定方法平行測試5份，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1、2。大黃素的加樣回收率在98.26%～102.33%之間，平均回收率為100.33%，RSD為1.743%；大黃酚的加樣回收率在98.33～102.96%之間，平均回收率為100.252%，RSD為1.942%。

表1 大黃素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

表2 大黃酚加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.10 樣品的含量測定 取不同的5個(gè)批號干燥至恒重的清涼膏2g，按“1.3.2”的方法在上述色譜條件下進(jìn)行測定，每個(gè)樣品平行測定3次，計(jì)算樣品中大黃素、大黃酚的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果(n=5)

3 討論

清熱涼血軟膏為中藥復(fù)方制劑，制樣過程中其基質(zhì)蜂蠟較難去除，本試驗(yàn)借鑒冰水浴冷卻過濾的方法來排除干擾，取得良好效果。本文參照《中國藥典》外用膏劑相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用高效液相色譜系統(tǒng)，以Dionex Ultimate 3000-C18為固定相，甲醇-0.1%磷酸(80∶20)為流動(dòng)相，初步建立了清涼膏中主要指標(biāo)成分大黃素、大黃酚的含量色譜測定方法。該方法與紫外分光法等其他方法相比較，檢驗(yàn)先進(jìn)，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可優(yōu)先用于清涼膏的質(zhì)量控制。

[1]鄭艷春，楊冬麗，崔雅慧，等．HPLC測定新健胃包芯片中大黃素大黃酚含量[J]．中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2012，6(22)：127-129．

[2]尹華，盛云杰．HPLC測定六味安消膠囊中大黃素、大黃酚的含量[J]．中醫(yī)藥學(xué)刊，2006，24(10)：1940-1942．

[3]國家藥典委．中華人民共和國藥典[M]．一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010．

[4]陳志琦． HPLC測定益心康泰膠囊中大黃素大黃酚含量[J]．中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(10)：88-89．

DeterminationoftheContentsofEmodinandChrysophonlinQingreliangxueOintmentbyHPLC

DING Ke，LV Yan， ZHU Tao

Department of Chinese Pharmacy，The First Affiliated hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang，Hangzhou 310005，China

ObjectiveTo establish a HPLC method to determinate the contents of Emodin and Chrysophanol in Qingreliangxue Ointment.MethodsThe analysis was used on a Dionex Ultimate 3000-C18(4.6mm×150mm,5μm);methanol-0.1%H3PO4(80∶20) as mobile phase; the flow rate was 1.0mL/min;the detection wavelength was 254 nm.ResultsA good linearity can be found in the range of 0.010～0.200μg (r=0.9999) in Emodin,the average recovery rate was 100.33%,RSD was1.743%(n=5);the linear ranges of chrysohonl at 0.020～0.400μg (r=0.9999),the average recovery rate was 100.253%,RSD was 1.942%(n=5).ConclusionThis method is reliable, rapid and accurate. It can be used to control the quality of Qingreliangxue Ointment.

Qingreliangxue Ointment; Emodin;Chrysophanol; HPLC

丁科，主管中藥師，主要從事中藥生藥學(xué)及臨床用藥研究。

R284

A

1007-8517(2014)15-0012-02

2014.06.08)