肺癌的下一代測(cè)序技術(shù)

南娟 翻譯 曹志成 校對(duì)

1天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津市肺癌研究所，天津市肺癌轉(zhuǎn)移與腫瘤微環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2香港特別行政區(qū) 伊利沙伯醫(yī)院 臨床腫瘤科

肺癌在生物學(xué)上具有侵襲性，并且是癌癥相關(guān)死亡的主要原因。全球每年有160萬(wàn)人診斷為肺癌，并有130萬(wàn)人死亡[1]。肺癌主要分為兩種類(lèi)型：非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell lung cancer, NSCLC）（占85%）和小細(xì)胞肺癌（約占15%）[2]。NSCLC可進(jìn)一步分為鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma, SCC）、腺癌（adenocarcinoma, ADC）和大細(xì)胞肺癌。小細(xì)胞肺癌的5年生存率僅為6%，遠(yuǎn)低于NSCLC的生存率（17%）。伴隨手術(shù)方法的完善和化放療的聯(lián)合應(yīng)用，肺癌的1年相對(duì)生存率從35%（1975年-1979年）升至43%（2003年-2006年）。但是，綜合所有分期，生存期超過(guò)5年的患者僅有16%。如果肺癌在局限期時(shí)即被發(fā)現(xiàn)，則5年生存率可達(dá)53%。然而，僅15%的肺癌患者在局限期被診斷出來(lái)[101]。

鑒于肺癌的嚴(yán)重后果及眾多治療失效的經(jīng)驗(yàn)，研究者將更多的精力投入到認(rèn)識(shí)該病病因?qū)W的潛在機(jī)制，以期鑒定新型藥物靶標(biāo)。人們很早就認(rèn)識(shí)到，肺癌是一種異質(zhì)性疾病，而且基因組改變?cè)谠摬〉陌l(fā)生中起至關(guān)重要的作用。在過(guò)去的幾年中，基因組測(cè)序技術(shù)取得飛速進(jìn)展。傳統(tǒng)上基于毛細(xì)管的單基因測(cè)序的第一代技術(shù)（如Sanger測(cè)序法）已被新一代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing, NGS）所替代，因?yàn)镹GS允許大量平行測(cè)序，而且具有成本更低和通量更高的特點(diǎn)。與傳統(tǒng)方法相比，NGS技術(shù)取得顯著進(jìn)步，包括對(duì)完整基因組、外顯子組和轉(zhuǎn)錄組的全面測(cè)序。較傳統(tǒng)方法，其還具有發(fā)現(xiàn)新型染色體重排和拷貝數(shù)目改變的優(yōu)勢(shì)[3]。這些技術(shù)進(jìn)展可革新我們對(duì)癌癥（如肺癌）的認(rèn)識(shí)。

在本綜述中，我們對(duì)各種NGS技術(shù)做了簡(jiǎn)要的說(shuō)明和總結(jié)。我們探討了至今為止NGS在肺癌中的應(yīng)用及重要發(fā)現(xiàn)。但是，NGS在肺癌診斷中的應(yīng)用不在本綜述范圍內(nèi)。

下一代測(cè)序技術(shù)

NGS通常是指第二代和第三代測(cè)序技術(shù)。這兩者的平臺(tái)比第一代Sanger測(cè)序技術(shù)均具有更好的能效比和更高的通量。根據(jù)目標(biāo)樣本資源和覆蓋范圍，NGS包括，但不局限于，全基因組測(cè)序（whole-genome sequencing,WGS）（針對(duì)DNA）、全外顯子組測(cè)序（whole-exome sequencing, WES）（針對(duì)DNA）、全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（針對(duì)RNA的RNA-seq）和靶向靶標(biāo)測(cè)序（DNA和RNA），詳細(xì)內(nèi)容如下所述。所有測(cè)序的材料預(yù)備起始于已剪切的DNA或RNA樣本，隨后為資料構(gòu)建。

全基因組測(cè)序

WGS可以對(duì)整個(gè)基因組進(jìn)行測(cè)序，提供最全面的基因組特征和最高水平的基因組測(cè)序。許多長(zhǎng)度為5個(gè)-200個(gè)核苷酸的隨機(jī)短DNA片段可以采用此方法同時(shí)進(jìn)行測(cè)序[3]。人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成會(huì)產(chǎn)生人類(lèi)基因組序列的總參照，在人類(lèi)基因組計(jì)劃完成之前很難解釋這些短序列。在所有NGS方法中，WGS花費(fèi)最高。但是，隨著技術(shù)的完善，WGS日漸便宜[3]。WGS成為一種既可獲取全面基因編碼序列又有助于明確影響疾病發(fā)生和進(jìn)展因素的有效工具[4]。WGS可以檢測(cè)所有基因組變異，產(chǎn)生了龐大的數(shù)據(jù)集。數(shù)據(jù)挖掘仍然是面臨的主要挑戰(zhàn)之一，必須加以解決，以實(shí)現(xiàn)個(gè)體化醫(yī)療的需求[4]。WGS雖費(fèi)錢(qián)費(fèi)時(shí)，但與傳統(tǒng)測(cè)序方法（Sanger測(cè)序）相比，WGS可以識(shí)別平衡染色體易位和倒位的斷點(diǎn)，從而有了獨(dú)特的應(yīng)用[5]。此外，WGS可檢測(cè)基因編碼區(qū)外發(fā)生的基因組變異。這些區(qū)域包括非編碼的體細(xì)胞突變，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子、非編碼RNAs（例如，miRNAs）和未注釋的區(qū)域[6,7]。激活的遺傳變異也可以通過(guò)WGS進(jìn)行鑒定，有助于我們理解遺傳性疾病和遺傳危險(xiǎn)因素引發(fā)癌癥的本質(zhì)。WGS可進(jìn)一步促進(jìn)疾病的篩查和診斷及個(gè)體化治療的制定[5]。

WGS是用于癌癥基因組深度測(cè)序的主要技術(shù)，因?yàn)樗峁┝它c(diǎn)突變、融合基因、插入缺失和拷貝數(shù)目變異的廣泛信息。它還提供了染色體的復(fù)雜重排、核苷酸置換突變和重復(fù)序列，以及腫瘤的整個(gè)基因組的結(jié)構(gòu)重排，包括倒位、易位和復(fù)雜重排的信息[5]。目前，WGS在癌癥基因組研究中最顯著的貢獻(xiàn)是發(fā)現(xiàn)了點(diǎn)突變。在一項(xiàng)WGS研究中，一組配對(duì)的正常和腫瘤樣本對(duì)于區(qū)分真正的體細(xì)胞突變和遺傳性改變的結(jié)構(gòu)重排是必不可少的[5]。研究證實(shí)全基因組擴(kuò)增的DNA配對(duì)測(cè)序?qū)?shù)量有限的細(xì)胞是有效的[8]。通過(guò)這種新穎方法預(yù)測(cè)的基因組的覆蓋范圍和深度的測(cè)序數(shù)據(jù)與從未擴(kuò)增的基因組DNA的預(yù)測(cè)結(jié)果類(lèi)似。

全外顯子組測(cè)序

WES可用于基因組編碼外顯子的測(cè)序，為發(fā)現(xiàn)活化的體細(xì)胞突變提供了一種有效方法。傳統(tǒng)的基于毛細(xì)管的外顯子組測(cè)序已導(dǎo)致許多疾病中靶向體細(xì)胞突變的重要發(fā)現(xiàn)。就肺癌而言，部分突變發(fā)生于EGFR和ALK受體酪氨酸激酶[3]。盡管WES局限于有注釋基因的變異的編碼和拼接位點(diǎn)，但是它還可以檢測(cè)整個(gè)基因組中已知編碼基因的突變，具有較高的覆蓋性。WES不能檢測(cè)啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)區(qū)的改變[9]。起初，WES只用于外顯子組。目前它已擴(kuò)展至基因組的多個(gè)區(qū)段，包括外顯子側(cè)翼區(qū)、啟動(dòng)子、非翻譯區(qū)和miRNA基因的非編碼DNA。單個(gè)樣本的WES檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了多達(dá)25,000個(gè)變異，導(dǎo)致鑒定活化突變的挑戰(zhàn)。WES和WGS的最大區(qū)別是產(chǎn)生數(shù)據(jù)的數(shù)量和內(nèi)容的不同。一般而言，如果旨在發(fā)現(xiàn)目標(biāo)突變，WES更合適。WES用戶可受益于每個(gè)樣本的花費(fèi)和分析時(shí)間的減少，感興趣區(qū)域的覆蓋范圍的增加以及突變信息的準(zhǔn)確性的提高[10]。事實(shí)上，干擾蛋白功能的基因編碼區(qū)域的突變或變異可被WES識(shí)別，而結(jié)構(gòu)和非編碼變異僅能被WGS檢測(cè)。請(qǐng)注意，許多用于WGS的平臺(tái)還適用于WES。一項(xiàng)重要挑戰(zhàn)是從伴隨變異中識(shí)別致病突變，而伴隨變體與疾病病因無(wú)關(guān)[11]。WGS和WES在檢測(cè)插入缺失、三核苷酸重復(fù)和拷貝數(shù)目的變異中均有困難[9]。

WES為罕見(jiàn)的孟德?tīng)栠z傳疾病的致病基因組變異的發(fā)現(xiàn)提供了難得機(jī)會(huì)[12-15]。WES主要應(yīng)用于表征單基因疾病（孟德?tīng)栠z傳疾?。┑娜毕?，這些缺陷可引起罕見(jiàn)的家族性疾病。從小型家族收集的個(gè)別罕見(jiàn)基因變體突變可被WES識(shí)別。這種方法亦可用于發(fā)現(xiàn)活化的突變。外顯子突變或拼接位點(diǎn)突變是多數(shù)孟德?tīng)栠z傳疾病的主要原因[12]。此外，外顯子組測(cè)序可能在非遺傳性或新生突變相關(guān)疾病中也具有較大潛能[15]。比如，它可能促進(jìn)腫瘤樣本中已知突變的診斷和新型突變的鑒定。

RNA測(cè)序

對(duì)從細(xì)胞中提取的RNA的測(cè)序（sequencing of RNA extracted from cells, RNA-seq）通過(guò)讀取短cDNA序列片段和基于參照基因組進(jìn)行繪制，產(chǎn)生了完整的轉(zhuǎn)錄組的全部序列。RNA-seq使得繪制外顯子和內(nèi)含子的邊界、以及基因的5′和3′末端成為可能，并導(dǎo)致人們對(duì)轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性有了更全面的了解[16]。傳統(tǒng)意義上，RNA-seq要求在資料構(gòu)建前通過(guò)雜交對(duì)poly(A)進(jìn)行選擇，以便富集RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄物和/或減少核糖體RNA的含量，該領(lǐng)域的進(jìn)展使得我們直接可以在總RNA量為皮克時(shí)進(jìn)行工作，無(wú)需分餾步驟，分餾步驟會(huì)限制轉(zhuǎn)錄組的完整測(cè)序。RNA-seq在檢測(cè)框內(nèi)融合[3]、體細(xì)胞突變[3]和基因表達(dá)序列分析[5]時(shí)具有敏感性和有效性。在量化豐富的轉(zhuǎn)錄物，尤其是當(dāng)這些轉(zhuǎn)錄物表達(dá)較低時(shí)，RNA-seq較微陣技術(shù)具有更高的敏感性[17]。RNA-seq技術(shù)不僅可用于分析既往已知基因，而且可檢測(cè)當(dāng)前未知轉(zhuǎn)錄物、選擇性剪接物和非人類(lèi)轉(zhuǎn)錄物[5]。RNA-seq面臨三大挑戰(zhàn)：資料構(gòu)建、數(shù)據(jù)挖掘和覆蓋范圍與花費(fèi)的比較[18]。

靶向測(cè)序

靶向測(cè)序通過(guò)只對(duì)靶區(qū)域測(cè)序而僅用于感興趣的基因組區(qū)域，以期達(dá)到節(jié)約時(shí)間和成本效益的分析。靶基因通常限定于既往已知癌癥相關(guān)的變異。與WGS相比，靶向測(cè)序產(chǎn)生了更小的數(shù)據(jù)庫(kù)，因此需要更簡(jiǎn)便的數(shù)據(jù)分析。該方法可能漏掉既往未知的突變。

NGS在肺癌中的應(yīng)用

自2008年NGS在肺癌中首次應(yīng)用發(fā)表后，多項(xiàng)研究采用不同的NGS方法研究除肺癌外的不同疾病。表1總結(jié)了這些研究的疾病類(lèi)型、臨床樣本、所采用的NGS方法、范圍、所用平臺(tái)和主要發(fā)現(xiàn)。其它細(xì)節(jié)如下所述。

NGS對(duì)既往已知靶基因的其它發(fā)現(xiàn)EGFR

在癌癥，尤其是NSCLC中，EGFR通過(guò)對(duì)可調(diào)節(jié)增殖和凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行調(diào)控，在腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用。EGFR的突變頻率見(jiàn)表2[20-26]。EGFR為NSCLC的重要基因變異，靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs；如吉非替尼和厄洛替尼）的出現(xiàn)為改善NSCLC的治療點(diǎn)燃希望。但是，由于其在一般NSCLC患者群中缺乏療效，最初的熱情受到挫傷。隨后，研究顯示EGFR突變對(duì)EGFR TKIs的療效至關(guān)重要[20]。2011年，美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)發(fā)布了一項(xiàng)初步臨床意見(jiàn)指出，采用EGFR抑制劑進(jìn)行一線治療需基于陽(yáng)性突變[27]。在過(guò)去的十年中，對(duì)可預(yù)測(cè)肺癌患者對(duì)EGFR TKIs的療效的生物標(biāo)記物的進(jìn)一步研究是一個(gè)活躍的研究領(lǐng)域。NGS技術(shù)在與EGFR TKI敏感性相關(guān)的其它基因標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)中起重要作用。

主要的EGFR突變?yōu)橥怙@子19的框內(nèi)缺失，這是采用EGFR抑制劑進(jìn)行個(gè)體化治療的有效標(biāo)記物。Marchetti等對(duì)116個(gè)NSCLC的DNA樣本通過(guò)傳統(tǒng)Sanger和NGS的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了比較[28]。其中，有106個(gè)樣本采用Sanger測(cè)序顯示外顯子19缺失，采用NGS分析也可見(jiàn)此突變。但是，僅88%（93個(gè)）的樣本通過(guò)NGS方法驗(yàn)證與Sanger測(cè)序具有相同的缺失。有13個(gè)（12%）病例的缺失通過(guò)兩種方法測(cè)序的特征不同。在這些缺失中，有6個(gè)樣本的缺失起點(diǎn)/終點(diǎn)未被Sanger測(cè)序檢測(cè)出且無(wú)法合理解讀。其它7個(gè)病例的缺失起點(diǎn)/終點(diǎn)明確，雖然缺失基質(zhì)的恰當(dāng)序列未被Sanger測(cè)序定義（如c.2240_2254del和c.2239_2262del），但可被NGS定義。通過(guò)NGS測(cè)序，在21個(gè)樣本（20%）中發(fā)現(xiàn)雙倍或多倍框移缺失相關(guān)的框內(nèi)改變。通過(guò)Sanger測(cè)序，16個(gè)病例的缺失為長(zhǎng)的和短的非框內(nèi)缺失（17 bp_del和1 bp_del），被認(rèn)定為缺失和插入。其它5個(gè)樣本被發(fā)現(xiàn)攜帶復(fù)雜缺失，這些缺失有可能是新的突變。這些突變包括：c.2239_2248del c.2253_2260del、c.2230_2237del c.2245_2251del、c.2239_2262del c.2263_2274dup（插入）、c.2236_ 2252del c.2258del和c.2234_ 2236del c.2241_2252del。除了主要缺失，還有攜帶不同缺失的DNA分子亞群，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上與主要缺失有關(guān)。NGS檢測(cè)46個(gè)（43%）樣本發(fā)現(xiàn)，每一亞群占有腫瘤基因組的0.1%-17%。外顯子19的復(fù)雜突變和缺失亞群的發(fā)現(xiàn)有可能解釋攜帶外顯子19突變的NSCLC患者的不同反應(yīng)［例如，反應(yīng)率：53.3%-75%；無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival, PFS）：7.1個(gè)月-398天］[20]。這項(xiàng)研究還說(shuō)明，外顯子19的某一區(qū)域也是高度變化的，這可能影響EGFR TKIs的個(gè)體化治療和肺癌的發(fā)病機(jī)理[28]。NGS有可能更全面地繪制EGFR外顯子19的缺失序列，由于該缺失的不同形式可能導(dǎo)致不同EGFR TKI反應(yīng)、疾病進(jìn)展，并可影響攜帶外顯子19缺失蛋白的抗原性[28]。

除了外顯子19的缺失，外顯子20的T790M也顯著影響著患者對(duì)EGFR TKI治療的反應(yīng)。該點(diǎn)突變主要與EGFR TKI治療的獲得性耐藥相關(guān)。比如，在肺ADC中，T790M突變導(dǎo)致50%以上的獲得性耐藥[25]。研究顯示，在TKI治療后可獲得EGFR T790M突變[29]。此外，EGFR T790M突變預(yù)處理在預(yù)測(cè)EGFR TKIs療效中的作用被研究。Su等采用直接測(cè)序、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間（Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight,MALDI-TOF）質(zhì)譜分析和NGS方法分析了EGFR TKIs治療前后的NSCLC患者的DNA樣本[30]。這些患者混雜著吸煙者（23.4%）和非吸煙者（76.6%），ADC（94.3%）或SCC（5.7%）。研究發(fā)現(xiàn)預(yù)處理和未處理T790M的患者的PFS間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.0298），而不同基因型的組別間對(duì)EGFR TKIs的反應(yīng)率和總生存期無(wú)明顯差異。仍有57%的攜帶T790M突變的患者對(duì)治療是有反應(yīng)的，該現(xiàn)象尚不能解釋。EGFR TKIs治療使T790M突變從治療前的31.5%升至治療后的83.3%。

ALK

最近，作為新興生物標(biāo)記物和治療靶標(biāo)的ALK酪氨酸激酶受體受到了廣泛關(guān)注。EML4-ALK易位是最常見(jiàn)的ALK基因重排。大約2%-11%的肺癌患者的EML4-ALK為陽(yáng)性[20]。采用基因組DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)1例43歲非吸煙男性NSCLC患者含有復(fù)雜的ALK重排，但根據(jù)Vysis ALK Break Apart FISH分析（Abbott Molecular Inc., IL, USA）其未攜帶突變的EGFR和EML4-ALK重排。連同其它的cDNA測(cè)序，研究顯示復(fù)雜重排包括至少5個(gè)不同的基因座內(nèi)有斷點(diǎn)。其中之一為ALK內(nèi)含子19和典型的EML4-ALK融合（EML4外顯子1-13，ALK外顯子20-29）。與外顯子1-19相比，外顯子20-29的表達(dá)高至39倍。此類(lèi)患者在服用克唑替尼后疾病有改善。由于NGS可以檢測(cè)復(fù)雜的ML4-ALK重排，而傳統(tǒng)的FISH分析不能檢測(cè)這些重排，所以可以考慮采用NGS來(lái)為NSCLC患者制定治療方案。

Jung和同事們對(duì)NSCLC組成的cDNA樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。通過(guò)NGS發(fā)現(xiàn)了228個(gè)融合轉(zhuǎn)錄物候選因子[31]。排除可能的假陽(yáng)性后降至16個(gè)。大多數(shù)融合基因里均有一個(gè)單序列。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-PCR進(jìn)一步證實(shí)了候選融合基因，而且僅從H2228細(xì)胞中產(chǎn)生了一個(gè)成功擴(kuò)增的融合基因（PTPN3-ALK）。5'-RACE產(chǎn)物分析顯示，ALK 5'的第11個(gè)內(nèi)含子至第8個(gè)內(nèi)含子片段轉(zhuǎn)位至PTPN3 5'端的第2個(gè)外顯子和第1個(gè)外顯子。此融合基因?qū)е翽TPN3一個(gè)等位基因的失活，PTPN3具有腫瘤抑制活性，并且是非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶的成員。這些發(fā)現(xiàn)有助于肺癌的診斷和治療。

KRAS

眾所周知，攜帶KRAS突變的NSCLC具有侵襲性，并且對(duì)EGFR TKIs耐藥。研發(fā)靶向突變KRAS的治療方法較為困難。通過(guò)Agilent Bioanalyzer（Agilent Technologies Inc., CA, USA）對(duì)15個(gè)原發(fā)肺癌腫瘤樣本進(jìn)行雙端RNA測(cè)序來(lái)識(shí)別攜帶KRAS突變的患者中明確改變的通路。人類(lèi)基因組和基因組圖譜被描述。網(wǎng)絡(luò)分析顯示在KRAS突變的腫瘤中存在差異表達(dá)（374個(gè)基因）、選擇性剪接（259個(gè)基因）和單核苷酸變異（single-nucleotide variant,SNV）相關(guān)的改變（65個(gè)基因）。在該項(xiàng)研究中，NF-kB、ERK1/2和AKT通路被證實(shí)可以激活，還發(fā)現(xiàn)了突變KRAS、TNFR和PPARγ信號(hào)通路的關(guān)系。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)相應(yīng)的靶向治療更為敏感，這將為EGFR TKI-耐藥的NSCLC患者提供替代的治療選擇[32]。

探索性研究中其它肺癌突變的鑒定KIF5B和RET融合基因

最近有3項(xiàng)研究報(bào)道了肺ADC患者中存在KIF5B和RET基因融合的新轉(zhuǎn)化[33-35]。在日本和美國(guó)的肺ADC患者中，該新型融合的發(fā)生率為1%-2%[34]。KIF5B和RET融合基因僅見(jiàn)于肺ADC患者，而不是肺癌的其它類(lèi)型（SCC、大細(xì)胞或小細(xì)胞肺癌）或ADC的其它類(lèi)型（卵巢和結(jié)腸）[33-35]。在許多腫瘤中RET是已知的致癌基因，如胰腺癌和前列腺癌。融合伙伴KIF5B有一個(gè)可激活致癌基因的卷曲螺旋域。該融合基因可以引起RET激酶的異?；罨?，并同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化[33,34]。它是一個(gè)額外的新型驅(qū)動(dòng)突變，因?yàn)樗窃?項(xiàng)獨(dú)立的研究中被發(fā)現(xiàn)的，且與既往已知的肺ADC突變或融合基因（如EGFR、KRAS和EML4-ALK）互相排斥[33-35]。KIF5B-RET融合基因是個(gè)體化靶向治療的潛在靶標(biāo)，而且可以通過(guò)多種靶向激酶抑制劑來(lái)成藥，如舒尼替尼、索拉菲尼以及剛被批準(zhǔn)的凡德他尼[34,35]。Ju等通過(guò)抑制RET的磷酸化，報(bào)道了對(duì)1例肺ADC患者的癌組織和配對(duì)正常組織的大規(guī)模并行全基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的整合分析[33]。此患者為33歲男性、非吸煙且無(wú)家族癌癥史。他未攜帶突變的EGFR、KRAS或EML4-ALK。血液DNA的WGS分析顯示，他的癌癥并非種系突變所驅(qū)動(dòng)，因?yàn)樗缓腥魏蜸NPedia［單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphism, SNP）數(shù)據(jù)庫(kù)］中已歸檔的明顯與癌癥相關(guān)的SNVs。通過(guò)比較肝臟中的轉(zhuǎn)移癌和正常組織，識(shí)別了10個(gè)非同義體細(xì)胞突變（8個(gè)SNVs和2個(gè)插入缺失）。這10個(gè)突變并不位于已知的靶基因（EGFR、KRAS和BRAF）上，其并非驅(qū)動(dòng)突變，甚至在原發(fā)肺轉(zhuǎn)移癌中也不是。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)θ诤匣虻倪M(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)了52個(gè)融合基因。其中，49個(gè)（94.2%）為相鄰基因的染色體內(nèi)融合，1個(gè)由于觸珠蛋白而產(chǎn)生。這503個(gè)基因在腫瘤發(fā)生中不起功能性作用。其它2個(gè)融合基因?yàn)镵IF5B-RET和KIAA1462-KIF5B。它們?yōu)槿旧w內(nèi)疏遠(yuǎn)基因（超過(guò)～2 Mb）的融合。鑒于KIAA1462-KIF5B表達(dá)較低，且KIAA1462為分子功能未知的假定蛋白，故不對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步地分析。所有52個(gè)融合基因中，在肝轉(zhuǎn)移性肺組織中通過(guò)WGS僅在KIF5B-RET中檢測(cè)到染色體重排（如大的缺失、倒位或易位）。RNA-seq發(fā)現(xiàn)此融合基因高表達(dá)34個(gè)不一致的雙端序列和60個(gè)跨越融合交界的生長(zhǎng)序列。分析還發(fā)現(xiàn)，KIF5B的第16個(gè)外顯子末端與RET原癌基因的第12個(gè)外顯子的起始端整合。10p11.22-q11.21的臂間倒位導(dǎo)致融合基因KIF5BRET。這些外顯子的RNA表達(dá)水平顯示，大部分RET表達(dá)來(lái)自融合基因，而不是野生型RET基因。隨后的重復(fù)研究在20個(gè)原發(fā)肺ADC的2個(gè)病例中證實(shí)了KIF5B-RET融合基因的出現(xiàn)。KIF5B中DNA雙鏈斷裂似乎是可變，3個(gè)患者中RET的第12個(gè)外顯子與KIF5B在不同位點(diǎn)結(jié)合（所檢測(cè)的患者為外顯子16，2個(gè)驗(yàn)證的患者為外顯子15和23）。研究顯示，KIF5B-RET融合基因?yàn)镹SCLCs的一個(gè)子集，還指出嵌合癌基因是采用相應(yīng)抑制劑進(jìn)行未來(lái)個(gè)體化治療的潛在分子靶標(biāo)。

最近，有2項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)肺癌中存在KIF5B-RET融合[34,35]。Kohno等采用逆轉(zhuǎn)錄PCR和Sanger測(cè)序分析了319個(gè)日本ADC患者的樣本[34]。其中，30個(gè)采用RNA-seq進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn)6個(gè)非吸煙患者攜帶KIF5B和RET融合基因。資料顯示，染色體10p11.2上的KIF5B內(nèi)含子15、16、23或24與染色體10q11.2上的RET內(nèi)含子7或11融合。FISH驗(yàn)證了染色體10的著絲粒區(qū)域的長(zhǎng)臂和斷臂間存在重排。KIF5B-RET融合陽(yáng)性患者的RET表達(dá)比其他人高30倍，與Ju等的結(jié)論一致，其結(jié)論認(rèn)為大部分RET癌基因來(lái)自融合基因[33]。在另一項(xiàng)81例美國(guó)患者和34例挪威患者的研究中，1例曾吸煙的美國(guó)患者存在KIF5B-RET融合陽(yáng)性。KIF5B-RET融合和吸煙狀態(tài)的關(guān)系未明。在融合陽(yáng)性的患者中發(fā)現(xiàn)KIF5B-RET蛋白Tyr905的磷酸化，提示RET融合是既往未知的突變。在另一項(xiàng)Lipson及其同事的研究中，研究者分析了24個(gè)福爾馬林固定石蠟包埋的NSCLC組織樣本[35]。發(fā)現(xiàn)1例44歲男性非吸煙者存在KIF5B-RET融合陽(yáng)性。進(jìn)一步的篩查發(fā)現(xiàn)，11例患者（561例肺ADC患者中）存在KIF5B-RET融合。

其它新發(fā)現(xiàn)

“癌癥標(biāo)志”是指一組對(duì)腫瘤發(fā)生至關(guān)重要的細(xì)胞特性。Imielinski等通過(guò)對(duì)183例肺ADC腫瘤和正常DNA配對(duì)的全外顯子組或全基因組進(jìn)行大規(guī)模并行測(cè)序繪制了癌癥標(biāo)志[36]。這183個(gè)病例的外顯子區(qū)域存在77,736個(gè)體細(xì)胞變異，平均為11.9個(gè)突變/Mb。與非吸煙患者相比，吸煙患者的外顯子突變率明顯升高（P=1.9×10-9）。CpG二核苷酸的C→T轉(zhuǎn)換（CpG→T）和C→A顛換是最常見(jiàn)的突變特征。A→C最少見(jiàn)。5個(gè)突變譜聚類(lèi)與患者的臨床特征相關(guān)。聚類(lèi)1（富集CpG→T突變，且總突變率較低）多見(jiàn)于非吸煙或輕度吸煙的患者（P=3.0×10-9）。聚類(lèi)4（除了CpG結(jié)構(gòu)和TpC突變?yōu)門(mén)或G外，還有C→T）與晚期明顯相關(guān)（IIIb期或IV期；P=0.006,3）。4個(gè)高突變率的分析發(fā)現(xiàn)了共計(jì)25個(gè)明顯的突變基因，部分基因之前已知，為T(mén)P53（頻率與既往報(bào)道一致，為50%）、KRAS（27%）、EGFR（17%）、STK11（15%）、KEAP1（12%）、ATM、NF1（11%）、BRAF（8%）和SMAD4（3%）。其余未見(jiàn)報(bào)道，為SMARCA4、ARID1A、RBM10、SETD2、PICK3CA、CBL、FBXW7、PPP2R1A、RB1、CTNNB1、U2AF1、KIAA0427、PTEN、BRD3、FGFR3和GOPC。對(duì)這25個(gè)基因的進(jìn)一步相關(guān)分析顯示，EGFR突變與KRAS突變明顯相斥（P=3.3×10-4）；EGFR突變與非/輕度吸煙（P=2.0×10-6）及突變譜聚類(lèi)1相關(guān)（P=0.001,5），KRAS、STK11、SMARCA4和KEAP1與突變譜聚類(lèi)1和非/輕度吸煙狀態(tài)負(fù)相關(guān)（P＜0.005）；突變譜聚類(lèi)3除了CpG外還有C→A顛換，富含KRAS變異（P=0.000,71）；STK11與突變譜聚類(lèi)2（CpG→T轉(zhuǎn)換和CpG→A顛換；P=0.002,6）相關(guān)；NF1與U2AF1可同時(shí)發(fā)生。PFS的相關(guān)分析顯示，U2AF1和TP53突變導(dǎo)致生存期縮短（分別為P=0.000,11和0.001,4）。U2AF1為最明顯的突變基因之一，在患者中的發(fā)生率為3%。5個(gè)病例中有4個(gè)發(fā)現(xiàn)相同的c.101C＞T、p.S34F突變。在這4個(gè)病例中，1例為KRAS突變陽(yáng)性，提示U2AF1具有獨(dú)立地致癌作用。RBM10占突變的7%（12/183）。RBM10高表達(dá)，為RNA結(jié)合蛋白。RBM10與KRAS、EGFR或PIK3CA可同時(shí)發(fā)生。ARID1A在患者中的陽(yáng)性率為8%，在SWI-SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物中編碼重要的蛋白質(zhì)。WGS揭示了范圍廣泛的總重排、基因重排和基因組的復(fù)雜性。通過(guò)檢測(cè)肺癌中新的激酶基因的潛在活化框內(nèi)重排發(fā)現(xiàn)了EGFR的兩個(gè)外顯子缺失。這一重排發(fā)生在EGFR的C末端（由外顯子25和26編碼），且可見(jiàn)另一變異（p.G719S突變）。在NIH 3T3細(xì)胞中進(jìn)一步研究了該突變，發(fā)現(xiàn)EGFR和AKT磷酸化增多，EGF磷酸化未見(jiàn)增加。在Ba/F3細(xì)胞中，致癌EGFR缺失突變導(dǎo)致增殖，該增殖可被厄洛替尼（一種EGFR TKI）阻止。WGS分析還發(fā)現(xiàn)SIK2和ROCK1的框內(nèi)重排。該研究有助于肺ADC基因組變異的完成和表征。

表 3 癌癥基因組圖譜項(xiàng)目公布的肺癌的下一代基因測(cè)序

Ding等報(bào)道了一項(xiàng)在188例肺ADC中進(jìn)行的合作研究，發(fā)現(xiàn)了26個(gè)與癌變相關(guān)的高變頻基因，包括EGFR同類(lèi)物ERBB4、ERBB3和ERBB2[37]。在這26個(gè)基因中，Greulich等選擇了6個(gè)受體酪氨酸激酶基因（EPHA3、ERBB4、FGFR4、NTRK3、NTRK2和ERBB2）來(lái)研究肺ADC中基因突變的功能意義[38]。他們發(fā)現(xiàn)ERBB2的致癌胞外區(qū)突變，該突變可使NIH 3T3細(xì)胞具有錨著獨(dú)立性。ERBB2的活化通過(guò)增加羧基端尾部的磷酸化或共價(jià)二聚化來(lái)啟動(dòng)。胞外區(qū)突變的ERBB2的抑制劑為治療選擇提供了希望，促使了一項(xiàng)臨床試驗(yàn)來(lái)研究肺癌中ERBB2的抑制劑。他們的結(jié)果與癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas, TCGA）的結(jié)論一致，TCGA結(jié)論認(rèn)為ERBBs可能是以下討論的一種分子靶標(biāo)[39]。

癌癥基因組研究的全局協(xié)調(diào)

國(guó)際癌癥基因組協(xié)會(huì)（International Cancer Genome Consortium, ICGC）舉國(guó)際之力調(diào)查癌癥的全球圖譜并全面鑒定與腫瘤相關(guān)的基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀基因改變，包括50種癌癥類(lèi)型的基因組缺失或擴(kuò)增、體細(xì)胞突變、基因重排、表觀遺傳修飾和基因的異常表達(dá)[10,102]。目前，15個(gè)行政轄區(qū)的51個(gè)組已加入ICGC，包括亞洲、澳洲、歐洲和北美洲，共研究超過(guò)24,000個(gè)腫瘤基因組[102]。TCGA計(jì)劃于2005年由國(guó)家癌癥研究院和國(guó)家人類(lèi)基因組研究院?jiǎn)?dòng)，有助于ICGC。TCGA通過(guò)NGS技術(shù)為癌癥分子特征提供了更全面的認(rèn)識(shí)。TCGA納入了超過(guò)20種癌癥常見(jiàn)類(lèi)型（包括肺癌），每種癌癥類(lèi)型有500個(gè)樣本。致力于不同但相關(guān)項(xiàng)目的研究和技術(shù)團(tuán)隊(duì)的國(guó)家網(wǎng)絡(luò)表現(xiàn)出了極大的進(jìn)展，總結(jié)見(jiàn)表3[40,103]。

作為T(mén)CGA項(xiàng)目的一部分，一項(xiàng)旨在全面表征SCC基因組和表觀基因組圖譜、發(fā)現(xiàn)SCC潛在治療方法的大型隊(duì)列研究于近年公布[39]。在該研究納入的178例患者中，96%有吸煙史。研究發(fā)現(xiàn)了復(fù)雜的基因組變異，每一腫瘤平均含有360個(gè)外顯子突變、165個(gè)基因組重排和323個(gè)拷貝數(shù)目變異的片段。染色體3q的選擇性擴(kuò)增是SCC與肺ADC的最大區(qū)別。研究發(fā)現(xiàn)有50個(gè)峰存在明顯的擴(kuò)增或缺失。在這些變異中，有一些體細(xì)胞拷貝數(shù)目變異曾被報(bào)道，包括SOX2、PDGFRA和/或KIT、EGFR、FGFR1和/或WHSC1L1、CCND1和CDKN2A。對(duì)SCC患者而言，最常見(jiàn)的突變?yōu)镃pG的轉(zhuǎn)換和顛換。該研究識(shí)別出10個(gè)復(fù)發(fā)突變基因（TP53、CDKN2A、PTEN、PIK3CA、KEAP1、MLL2、HLA-A、NFE2L2、NOTCH1和RB1）。TP53突變最為頻繁（81%）。有研究識(shí)別出4條明顯變異的通路，為NFE2L2和KEAP1和/或CUL3缺失或突變（34%），鱗狀細(xì)胞分化（44%），磷脂酰肌醇-3-OH激酶通路（47%）以及CDKN2A和RB1（72%）。KEAP1和CUL3突變與功能喪失相關(guān)。鱗狀細(xì)胞分化基因包括SOX2和TP63的過(guò)表達(dá)和擴(kuò)增，NOTCH1、NOTCH2、ASCL4的功能喪失突變和FOXP1的局部缺失。CDKN2A是編碼p16INK4A和p14ART蛋白的腫瘤抑制基因。

伴隨潛在靶標(biāo)基因的篩查及藥物研發(fā)的需要，研究者建議了3個(gè)分子靶向策略：ERBBs、FGFRs和JAKs，這三者均被發(fā)現(xiàn)有突變和/或擴(kuò)增。ERBB2的結(jié)果與Greulich等的結(jié)論（ERBB2可能是靶向治療的獨(dú)特機(jī)會(huì)）[38]相符。此外，Govindan等在2012年的美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)會(huì)議上呈現(xiàn)了178例SCC患者的全部基因組特征[41]。他們發(fā)現(xiàn)了30個(gè)明顯體細(xì)胞拷貝數(shù)目變異的位點(diǎn)和13個(gè)明顯突變的基因（包括TP53、CDKN2A、PTEN、KEAP1和NFE2L2），識(shí)別出4個(gè)不同的表達(dá)：NFE2L2和KEAP1突變、FGFR激酶變異、總體甲基化增加和煙草使用率最高。72%的病例存在CDKN2A缺失。對(duì)于現(xiàn)有可用藥物，75%的患者含有潛在的分子靶標(biāo)。

TCGA整合了研究機(jī)構(gòu)間大量系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)的測(cè)序數(shù)據(jù)。事實(shí)上整個(gè)研究機(jī)構(gòu)可以訪問(wèn)所有的數(shù)據(jù)資料，從而加速?gòu)难芯堪l(fā)現(xiàn)到臨床的轉(zhuǎn)化工作。TCGA組的進(jìn)展顯示許多基因組信息穿插在不同的腫瘤類(lèi)型間[42-44]，包括肺癌。此外，源自TCGA的數(shù)據(jù)也可能用于驗(yàn)證原創(chuàng)研究的結(jié)果[45]，或作為質(zhì)量控制[46]。

未來(lái)前景

2003年人類(lèi)基因組計(jì)劃完成后，NGS技術(shù)改進(jìn)明顯增加了基因組數(shù)據(jù)量，這些數(shù)據(jù)由檢測(cè)罕見(jiàn)結(jié)構(gòu)變異中基因組覆蓋范圍和細(xì)微差別增多的研究產(chǎn)生。隨著技術(shù)改進(jìn)，這些技術(shù)在研究中的實(shí)用性及其潛在臨床應(yīng)用也有所增加。NGS方法允許我們深入挖掘遺傳密碼，以識(shí)別大量潛在的基因和基因組差異（如結(jié)構(gòu)異常、拷貝數(shù)目增加和體細(xì)胞SNVs）。他們?yōu)槲覀兲峁┝私饷馨┌Y基因組中復(fù)雜基因改變的工具。通過(guò)提供既往已知疾病/治療相關(guān)基因靶標(biāo)的全面基因組圖譜，NGS可能提高我們選擇恰當(dāng)?shù)闹委熕幬锏哪芰?。而且，NGS發(fā)現(xiàn)了許多其它的基因組標(biāo)記物，它們對(duì)致病/治療很重要。通過(guò)該方法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)使研究者可以實(shí)施旨在提高我們對(duì)生物學(xué)和患者治療的認(rèn)識(shí)的系統(tǒng)生物學(xué)研究，最終實(shí)現(xiàn)真正地個(gè)體化用藥。如本綜述所總結(jié)，NGS為探索更多的基因變異提供了機(jī)會(huì)，這些基因變異可能導(dǎo)致有前景的治療靶標(biāo)。此外，國(guó)際間合作網(wǎng)絡(luò)通過(guò)研究機(jī)構(gòu)分享數(shù)據(jù)庫(kù)和技術(shù)，如ICGC，會(huì)加快每一個(gè)體患者突變圖譜發(fā)現(xiàn)的步伐。NGS相關(guān)的臨床挑戰(zhàn)是，所述病癥并不總是與臨床實(shí)踐中所觀察到的疾病相關(guān)[15]。通過(guò)使用有效的靶向治療，大多數(shù)現(xiàn)已識(shí)別的突變并未轉(zhuǎn)化至臨床實(shí)踐。點(diǎn)突變的有效使用仍為實(shí)現(xiàn)癌癥個(gè)體化用藥的一項(xiàng)挑戰(zhàn)。

即使有了這些進(jìn)展，挖掘NGS分析產(chǎn)生的龐大數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析并將其轉(zhuǎn)化為醫(yī)療保健仍具有挑戰(zhàn)性。疾病的異質(zhì)性以及患者伴有其它環(huán)境影響，增加了解釋NGS結(jié)果的難度。為了將NGS結(jié)果真正地轉(zhuǎn)化為臨床癌癥治療，需要進(jìn)一步采用先進(jìn)的軟件程序進(jìn)行生物信息學(xué)分析、對(duì)NGS結(jié)果進(jìn)行功能驗(yàn)證和臨床試驗(yàn)確認(rèn)。

有證據(jù)表明，攜帶既往已知靶標(biāo)如EGFR和ALK重排的患者可獲益于相應(yīng)的抑制劑治療[20]。傳統(tǒng)方法無(wú)法解釋一些患者可獲益于臨床上地初始治療，但會(huì)發(fā)展為耐藥并對(duì)該治療產(chǎn)生不同反應(yīng)。NGS可能通過(guò)采用更多的全面測(cè)序來(lái)明確病因。比如，Marchetti等發(fā)現(xiàn)了外顯子19的復(fù)雜突變和缺失亞群[28]。NGS有助于為患者尋找恰當(dāng)?shù)陌邢蛑委煛６?，現(xiàn)有可用的分子靶向藥物在肺ADC中普遍使用。NGS還有望發(fā)現(xiàn)其它肺癌類(lèi)型的藥物靶標(biāo)。此外，NGS無(wú)疑會(huì)改善癌癥診斷，這些不在本綜述范圍之內(nèi)。預(yù)計(jì)將有更有效的靶標(biāo)和生物標(biāo)記物被發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證，就像采用NGS分析所產(chǎn)生的癌癥領(lǐng)域的發(fā)現(xiàn)會(huì)有持續(xù)進(jìn)展一樣。NGS技術(shù)還有助于提高我們對(duì)癌癥致病基因突變/變異的認(rèn)識(shí)，期待有更多生物標(biāo)記物和潛在藥物靶標(biāo)通過(guò)NGS被發(fā)現(xiàn)。

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The authors have no relevant affliations or financial involvement with any organization or entity with a financial interest in or financial conflict with the subject matter or materials discussed in the manuscript. This includes employment, consultancies,honoraria, stock ownership or options, expert testimony, grants or patents received or pending, or royalties.

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注：本表得到版權(quán)所有者 ? 2013 Future Medicine Ltd復(fù)制許可。