rs1333049多態(tài)性與漢族人群多囊卵巢綜合征的相關(guān)性研究

張 文，王彬彬，王 晶，陳蓓麗，徐玉萍，曹云霞

rs1333049多態(tài)性與漢族人群多囊卵巢綜合征的相關(guān)性研究

張 文1，王彬彬2，3，王 晶4，陳蓓麗1，徐玉萍1，曹云霞1

目的 了解單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP）rs1333049與多囊卵巢綜合征（PCOS）的關(guān)系。方法 采用以睪酮激素水平配對(duì)的患者作為對(duì)照者進(jìn)行研究，對(duì)139例PCOS患者及141例對(duì)照者進(jìn)行研究。采用實(shí)時(shí)熒光PCR TaqMan探針?lè)椒▽?duì)INK4區(qū)域反義非編碼 RNA（ANRIL）的一個(gè)SNPrs1333049進(jìn)行基因分型分析。結(jié)果 在PCOS患者中，各項(xiàng)生化指標(biāo)和臨床表現(xiàn)在各基因型之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PCOS患者和對(duì)照者間基因型分布和等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.87，P=0.17;χ2=3.25，P=0.20）。結(jié)論 染色體9p21上rs1333049多態(tài)性與PCOS高雄激素患者無(wú)關(guān)。

多囊卵巢綜合征;ANRIL;rs1333049;中國(guó)漢族

曹云霞，女，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E－mail:caoyunxia6@126.com

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是較為常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂的疾病，在育齡期婦女中發(fā)病率為5% ～10%［1－2］。根據(jù)美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)/歐洲社會(huì)人類(lèi)生殖和胚胎學(xué)會(huì)鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)，PCOS的診斷必須至少符合以下條件中的兩個(gè):①稀發(fā)排卵或無(wú)排卵;② 高雄激素血癥或高雄激素的臨床表現(xiàn)（如多毛、痤瘡等）;③ 超聲提示多囊卵巢［3］。在不同表型的PCOS患者中，雄激素過(guò)多都是心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素［4］。INK4區(qū)域反義非編碼RNA（antisense non coding RNA in the INK4 locus，ANRIL）位于染色體9p21，且因其與心血管疾病發(fā)生的可疑作用而得到突顯［5］。有研究［6］提示染色體9p21上某區(qū)域內(nèi)存在有風(fēng)險(xiǎn)的單體型對(duì)于歐洲人群的心血管疾病中起到重要作用，其中就包括了rs1333049這一單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。該研究旨在評(píng)估染色體9p21上代表性多態(tài)性位點(diǎn)rs1333049［7］與中國(guó)漢族人群中患有多囊卵巢綜合征的患者之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取280名婦女分為兩組:PCOS患者組及對(duì)照組。根據(jù)美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)/歐洲社會(huì)人類(lèi)生殖和胚胎學(xué)會(huì)鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)，共識(shí)診斷PCOS患者139例。診斷標(biāo)準(zhǔn)如下:①月經(jīng)稀少;黃體生成素（luteinizing hormone，LH）/卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）≥2;② 高雄激素血癥，血總睪酮（Total testosterone，TT）＞2.8 nmol/L;③ 超聲提示多囊卵巢。對(duì)照組141例女性有正常月經(jīng)周期，正常的FSH、LH、TT生化檢查結(jié)果，并且沒(méi)有PCOS癥狀或任何其他類(lèi)型的慢性無(wú)排卵疾病?；颊邅?lái)源于在醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的不孕癥患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患者知情同意及簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 一般資料的采集 采用統(tǒng)一的調(diào)查問(wèn)卷，了解研究對(duì)象的一般資料和臨床資料，如年齡、月經(jīng)史、婚育史等。

1.2.2 生化指標(biāo)的檢測(cè) 內(nèi)分泌激素測(cè)定:抽血時(shí)間為早卵泡期即月經(jīng)周期的第5～7天，閉經(jīng)者無(wú)時(shí)間限制，取空腹靜脈血用放射免疫法測(cè)定雌二醇（estradiol，E2）、孕激素（progesterone，P）、睪酮（testosterone，T）、FSH、LH、血清泌乳素（plasma prolactin，PRL）。

1.2.3 基因型分析 基因序列信息來(lái)自Hapmap數(shù)據(jù)庫(kù)。實(shí)時(shí)定量熒光PCR反應(yīng)體系為10 μl，基因組 DNA 1μl，5 μl 2 × TaqMan Universal PCR Master Mix，3.5 μl雙蒸水和0.5 μl 20 ×Assay Mix。反應(yīng)條件為:60℃ 30 s，95℃預(yù)變性10 min，95℃ 10 s，60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)?；蚍中头譃?GG、CG、CC型。檢測(cè)儀器為StepOne PCR real time Sys－tem（美國(guó)ABI公司），分析軟件為SDS software 2.0（美國(guó)ABI公司）。每個(gè)檢測(cè)單元均設(shè)立陰性對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，PCOS患者組和對(duì)照組間基因型和等位基因頻率差異（計(jì)量資料）比較運(yùn)用χ2檢驗(yàn)，PCOS患者組和對(duì)照組臨床資料間（組間）差異運(yùn)用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 PCOS患者組和對(duì)照組FSH和LH水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PCOS患者組與對(duì)照組比較更具有發(fā)生心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)因子，如 T水平和身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）值（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 PCOS患者組與對(duì)照組臨床資料比較（±s）

表1 PCOS患者組與對(duì)照組臨床資料比較（±s）

項(xiàng)目 患者（n=139） 對(duì)照（n=141） P值年齡（歲） 25.73±3.8（17～35）29.79±3.6（23～40）＜0.01初潮年齡（歲） 15.0±2.2 14.49±1.3 0.23 BMI 23.00±5.0 21.66±2.9 ＜0.01身高 （cm） 160.0±4.9 160.23±5.2 0.15體重 （kg） 60.3±13.0 55.55±7.5 ＜0.01 E2（pmol/L） 257.99±173.1 156.05±75.9 ＜0.01 FSH（IU/L） 3.97±1.2 6.90±1.4 ＜0.01 LH（IU/L） 11.26±3.26 5.56±2.20 ＜0.01 PRL（ng/ml） 79.45±53.5 21.69±27.7 0.17 T（nmol/L）3.47±0.8 1.08±0.6 ＜0.01

2.2 基因型分析

2.2.1 TaqMan探針基因分型圖 結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 rs1333049位點(diǎn)3種基因型的TaqMan探針結(jié)果

2.2.2 基因型及等位基因頻率 PCOS患者組與對(duì)照組間基因型分布和等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.87，P=0.17;χ2=3.25，P=0.20）。見(jiàn)表2。

3 討論

PCOS不僅是一個(gè)生殖障礙疾病，同時(shí)也是一種可能長(zhǎng)期影響婦女健康的代謝性疾病。根據(jù)鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)PCOS表型得到擴(kuò)展，包括有高雄激素表現(xiàn)的正常月經(jīng)周期婦女和無(wú)雄激素過(guò)高的月經(jīng)周期不規(guī)律的婦女。最近根據(jù)鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估不同PCOS表型的內(nèi)分泌指標(biāo)，有高雄激素血癥表現(xiàn)的所有表型都有腰圍增加和胰島素抵抗，而有多囊卵巢形態(tài)的無(wú)排卵非高雄激素血癥的患者與對(duì)照比較卻無(wú)此趨勢(shì)。這就帶來(lái)一個(gè)新的問(wèn)題，這些新的PCOS表型是否存在代謝紊亂，甚至增加罹患糖尿病或心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，循環(huán)內(nèi)的內(nèi)源性雄激素在代謝改變，以及PCOS患者和健康女性體內(nèi)的心血管系統(tǒng)中的作用仍不清楚。在部分同樣的樣本中檢測(cè)出過(guò)早動(dòng)脈粥樣硬化升高的血清標(biāo)志物，如C反應(yīng)蛋白和同型半胱氨酸以及內(nèi)皮功能障礙。PCOS患者是早發(fā)心血管疾病高風(fēng)險(xiǎn)的最大群體［8］。近期文獻(xiàn)［9］報(bào)道有增厚的頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度（intima－media thickness，IMT）的 PCOS患者相較于健康對(duì)照者而言動(dòng)脈粥樣硬化傾向性明顯增加，而IMT可通過(guò)無(wú)創(chuàng)檢查對(duì)潛在的血管疾病進(jìn)行評(píng)價(jià)?；谝阎男难艽x的風(fēng)險(xiǎn)因子，PCOS患者心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)較正常女性高出5～7倍［10］。

表2 PCOS患者組和對(duì)照組中rs1333049（C/G）基因型和等位基因頻率［n（%）］

染色體9p21上這個(gè)區(qū)域含有編碼2個(gè)細(xì)胞周期依賴(lài)激酶抑制因子—CDKN2A和CDKN2B基因的編碼序列。這兩個(gè)基因在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中起重要作用，并且可能通過(guò)其在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）－β誘導(dǎo)生長(zhǎng)抑制中的作用參與到動(dòng)脈粥樣硬化的病理過(guò)程中［11－12］。有報(bào)道［13］稱(chēng)染色體 9p21 上 ANRIL 參與到CDKN2B－p16/CDKN2Ap14細(xì)胞周期基因簇的調(diào)節(jié)。rs1333049多態(tài)性是與疾病相關(guān)因子中聯(lián)系最強(qiáng)的。有前期研究［7］證實(shí)rs1333049與多種心血管疾病之間存在相關(guān)性。然而，在PCOS患者組與對(duì)照組間rs1333049位點(diǎn)基因型分布與等位基因頻率并無(wú)顯著性差異;致使無(wú)法確定兩者之間的聯(lián)系。在心血管疾病病理發(fā)生過(guò)程中有多種風(fēng)險(xiǎn)因子參與，而在實(shí)驗(yàn)中PCOS患者的高T水平并不是心血管疾病發(fā)生的唯一病因。本研究收集病例均來(lái)自生育年齡婦女，而心血管疾病的發(fā)展則需要長(zhǎng)時(shí)間的過(guò)程，這有可能是另一個(gè)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法在PCOS和心血管疾病間建立聯(lián)系的原因。盡管絕經(jīng)后卵巢不能芳香化，但依然可以持續(xù)產(chǎn)生雄激素，所以絕經(jīng)效應(yīng)在循環(huán)內(nèi)雄激素水平改變上并不是很明顯。高雄激素血癥在中年持續(xù)的程度可能決定有PCOS病史的老年婦女罹患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)程度。

本研究是首次觀察rs1333049在有高雄激素血癥的PCOS患者身上發(fā)揮的作用。結(jié)果顯示rs1333049多態(tài)性位點(diǎn)可能與中國(guó)漢族人群中PCOS患者無(wú)明顯相關(guān)性。需要其他大樣本例數(shù)的實(shí)驗(yàn)，以求進(jìn)行更深入的研究，更真實(shí)地反映群體的情況。

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An association study of rs1333049 polymorphism with polycystic ovarian syndrome in Chinese Han population

Zhang Wen1，Wang Binbin2，3，Wang Jing4，et al
（1Dept of Reproductive Medicine Center，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022;2Center for Genetics，National Research Institute for Family Planning，Beijing100081;3Peking Union Medical
College，Beijing100730;4Dept of Medical Genetics，Capital Medical University，Beijing100069）

ObjectiveTo investigate the association between rs1333049 polymorphism and the risk of polycystic ovarian syndrome（PCOS）in Chinese population.Methods139 PCOS patients and 141 healthy control were divided in two groups by the level of testosterone.The TaqMan real time PCR technique was used to detect the genotypes of a single nucleotide polymorphism rs1333049 in ANRIL from the samples.ResultsIn PCOS women，no significant differences in endocrine clinical and biochemical variables were found between the genotypes.There was no significant difference in genotype distributions and allele frequencies for rs1333049 between PCOS patients and controls.（χ2=1.87，P=0.17;χ2=3.25，P=0.20）.ConclusionThis study demonstrates no association of rs1333049 polymorphism locus on chromosome 9p21 with the risk for PCOS in Han Chinese.

polycystic ovarian syndrome;ANRIL;rs1333049;Chinese Han population

R 588.6

A

1000－1492（2014）05－0622－03

2013－12－10接收

國(guó)家“973”項(xiàng)目（編號(hào):2012CB944704）;高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金（編號(hào):20093420110001）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心，合肥230022

2國(guó)家人口計(jì)生委科研所遺傳室，北京 100081

3中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，北京 100730

4首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳室，北京 100069

張 文，女，碩士研究生;