氯化鋰介導(dǎo)經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路在大鼠脂肪干細(xì)胞增殖和成骨中的作用

趙 璇，徐 燕，鄭桂婷，沈繼龍

氯化鋰介導(dǎo)經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路在大鼠脂肪干細(xì)胞增殖和成骨中的作用

趙 璇1，徐 燕1，鄭桂婷1，沈繼龍2

目的 探討在體外生長(zhǎng)環(huán)境下不同濃度氯化鋰對(duì)脂肪干細(xì)胞（ADSCs）增殖和成骨分化的作用及其可能的機(jī)制。方法 ①?gòu)?周齡SD大鼠腹股溝脂墊分離出脂肪組織，使用0.1%Ⅰ型膠原酶消化后置于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)，以 0、2.5、5、10、20、40 mmol/L 濃度的氯化鋰作用 ADSCs 24、48、72 h，用 MTT法測(cè)定氯化鋰對(duì)細(xì)胞增殖的作用;②ADSCs加入含0、2.5、5、10、20、40 mmol/L 氯化鋰的成骨培養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d后測(cè)定細(xì)胞中堿性磷酸酶（AKP）的活性;③用RT-PCR法檢測(cè)成骨誘導(dǎo)3 d后，不同濃度氯化鋰作用7 d時(shí)ADSCs中β-catenin、糖原合成激酶3β、AKP的表達(dá)。結(jié)果

在體外環(huán)境培養(yǎng)下，低濃度氯化鋰（2.5、5、10 mmol/L）促進(jìn)干細(xì)胞增殖，高濃度氯化鋰（20、40 mmol/L）抑制細(xì)胞增殖。5、10 mmol/L氯化鋰促進(jìn)ADSCs中AKP的活性，但是40 mmol/L具有明顯抑制AKP活性的作用。同時(shí)，氯化鋰能上調(diào)β-catenin和AKP的表達(dá)。結(jié)論 氯化鋰在體外對(duì)大鼠ADSCs增殖有雙重影響，并且促進(jìn)AKP活性和ADSCs成骨分化，具有劑量依賴(lài)性。5 mmol/L 濃度的氯化鋰可作為促進(jìn)大鼠ADSCs增殖和成骨分化的最適濃度。

Wnt信號(hào)通路;脂肪干細(xì)胞;氯化鋰;增殖;成骨分化

脂肪干細(xì)胞（adiposed-derived stem cell，ADSCs）由 Zuk et al［1］于2001年發(fā)現(xiàn)，因其易取得、儲(chǔ)量豐富性、自我增殖和多向分化的能力強(qiáng)等特點(diǎn)在牙周組織工程中引起關(guān)注［2］。Wnt信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移、基因表達(dá)等各項(xiàng)活動(dòng)［3］，特別是經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路更是對(duì)干細(xì)胞的增殖和分化起到關(guān)鍵性的作用。該研究旨在使用不同濃度氯化鋰對(duì)ADSCs進(jìn)行刺激，探討經(jīng)典Wnt/βcatenin通路對(duì)于ADSCs增殖和成骨向分化的作用以及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)3周齡SD大鼠，體重50 g，雌雄不限，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要儀器、試劑 DMEM、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶（HyClone公司，美國(guó)）;Ⅰ型膠原酶、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、地塞米松、氯化鋰、MTT（Sigma公司，美國(guó)）;堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）試劑盒（南京建成生物工程研究所）;TRIzol（Life Technologies公司，美國(guó)）;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、第一鏈cDNA合成試劑盒（MBI Fermentas公司，加拿大）;DNA Marker（TaKaRa公司，日本）;倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）;ELX808U酶標(biāo)儀（伯騰儀器，美國(guó)）;Nikon eclipse 80i成像系統(tǒng)（尼康株式會(huì)社，日本）;PCR儀（BIO-RAD公司，美國(guó)）;高速冷凍離心機(jī)（日本株式會(huì)社，日本）。

1.3 方法

1.3.1 ADSCs分離、培養(yǎng)以及傳代 SD大鼠ADSCs的分離主要采用酶消化法，無(wú)菌取大鼠腹股溝區(qū)脂肪墊，PBS漂洗2～3次后去除組織表面的筋膜、血管，剪碎至糊狀移至50 ml離心管。加入0.1% Ⅰ型膠原酶于管中，37℃消化30～40 min后加入含10%FBS的DMEM液終止消化，2 500 r/min離心5 min。離心結(jié)束后吸去最上層的油脂及中層的DMEM，僅保留下層脂肪細(xì)胞，加入5 ml含10%FBS的DMEM液重懸細(xì)胞。以200目細(xì)胞篩過(guò)濾，并加入適量的紅細(xì)胞裂解液，37℃孵育10 min裂解紅細(xì)胞。再次800 r/min離心5 min后棄上清液，PBS漂洗后離心取細(xì)胞沉淀，5 ml含10%FBS的DMEM液重懸細(xì)胞并接種于培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)，48 h后首次換液，以后每3 d換液1次，待細(xì)胞匯合至80%用PBS洗滌3次，加入0.25%的胰蛋白酶（含0.01%EDTA），當(dāng)細(xì)胞由梭形變?yōu)閳A形從瓶上脫落，用含10%FBS的DMEM液終止消化，吹打均勻并以1∶3比例傳代。傳至第3代備用。

1.3.2 MTT法檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化制備成單細(xì)胞懸液，密度為4 000個(gè)/孔接種于96孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層換成含氯化鋰終濃度為0、2.5、5、10、20、40 mmol/L 的新鮮無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，每個(gè)濃度平行接種3孔，在第1、2、3天時(shí)檢測(cè)，每孔加入 0.5%MTT 20 μl/孔，37 ℃ 孵育 4 h后，去除MTT，加入二甲基亞砜150 μl，低速震蕩90 r/min約10 min后，在492 nm處酶標(biāo)儀讀出吸光度值（OD492），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 AKP活性檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按4 000個(gè)/孔接種于96孔板內(nèi)，24 h后更換含不同濃度氯化鋰的成骨培養(yǎng)液，分為對(duì)照組（0 mmol/L）和實(shí)驗(yàn)組（2.5、5、10、20、40 mmol/L），作用 7 d 后檢測(cè)每組細(xì)胞AKP的活性。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。收集細(xì)胞后，依照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)，在酶標(biāo)儀520 nm波長(zhǎng)處讀取數(shù)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 RT-PCR法檢測(cè)Wnt信號(hào)通路組成以及成骨相關(guān)基因的表達(dá) 將細(xì)胞接種于6孔板中，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組（氯化鋰濃度為 2.5、5、10、20、40 mmol/L），成骨誘導(dǎo)3 d后氯化鋰處理7 d，TRIzol一步法提取總RNA;分光光度法測(cè)量RNA的濃度以及純度。使用Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用紫外透射分析儀觀察并且拍照，分析各個(gè)條帶積分光密度（intergrated option density，IOD），計(jì)算相對(duì)于GAPDH的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物由上海生工生物工程公司合成。見(jiàn)表1。

表1 mRNA擴(kuò)增引物名稱(chēng)、核苷酸序列及產(chǎn)物大小

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差（ANOVA）分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs形態(tài)學(xué) 在倒置顯微鏡下觀察，原代細(xì)胞剛接種時(shí)是懸浮于培養(yǎng)液中，24 h后小部分細(xì)胞零散貼壁，形態(tài)呈短梭形、三角形等，6～7 d后細(xì)胞體積增大，形態(tài)逐漸變化為長(zhǎng)梭形，類(lèi)似于成纖維細(xì)胞，呈漩渦狀生長(zhǎng)。當(dāng)細(xì)胞傳代次數(shù)增加，形態(tài)趨于均一，主要為梭形。見(jiàn)圖1。

圖1 倒置顯微鏡下第3代ADSCs形態(tài) ×100

2.2 氯化鋰對(duì)ADSCs增殖的影響 第1天氯化鋰對(duì)各組作用效果不顯著，各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第2、3天氯化鋰作用效果較明顯，低濃度氯化鋰（2.5、5、10 mmol/L）可以引起大鼠 ADSCs有絲分裂，有利于細(xì)胞增殖，第3天時(shí)效果顯著;高濃度氯化鋰（20、40 mmol/L）抑制細(xì)胞的增殖。見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度氯化鋰對(duì)大鼠ADSCs增殖的影響（n=3，±s）

表2 不同濃度氯化鋰對(duì)大鼠脂肪干細(xì)胞AKP活性的影響（n=3，±s）

表2 不同濃度氯化鋰對(duì)大鼠脂肪干細(xì)胞AKP活性的影響（n=3，±s）

與對(duì)照組（0 mmol/L）比較:*P＜0.05

氯化鋰（mmol/L） AKP活性（U/100 ml）2.330 ±0.520 2.5 2.903 ±0.527 5 4.616 ±0.732*10 3.346 ±0.629*20 2.070 ±0.585 40 1.443 ±0.130 0*

2.3 AKP活性檢測(cè) 大鼠ADSCs經(jīng)過(guò)氯化鋰處理7 d后檢測(cè)，與對(duì)照組比較，5、10 mmol/L組對(duì)細(xì)胞AKP活性的促進(jìn)作用較顯著。見(jiàn)表2。

2.4 RT-PCR 檢測(cè) 與對(duì)照組比較，β-catenin的mRNA表達(dá)量隨著氯化鋰濃度的升高而上升（F=64.74）。GSK-3β的mRNA表達(dá)量隨著氯化鋰濃度的升高而降低（F=47.51）。AKP mRNA表達(dá)在5 mmol/L組時(shí)最高，隨后依次下降（F=68.83）。見(jiàn)圖3。

圖3 不同濃度氯化鋰作用ADSCs 7 d后mRNA的表達(dá)

3 討論

脂肪干細(xì)胞被認(rèn)為是牙周組織再生技術(shù)中具有重大潛力的干細(xì)胞之一，因其有取材便利，儲(chǔ)量大，低免疫原性，自身可分泌多種生長(zhǎng)因子等多個(gè)優(yōu)勢(shì)［4］。干細(xì)胞體外增殖和成骨向分化在不同成骨階段涉及多個(gè)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，其中包括Wnt/βcatenin信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶途徑、Notch信號(hào)通路途徑、骨形態(tài)發(fā)生蛋白途徑等［5－6］。Wnt/β-catenin途徑是研究較多的經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，Wnt信號(hào)配體可以同跨膜蛋白低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6以及細(xì)胞膜上七次跨膜的卷曲蛋白受體（Frizzled、Fzd）結(jié)合，隨后Fzd胞內(nèi)區(qū)域作用于蓬松蛋白（Dishevelled、Dsh或Dvl），Dvl的活化可抑制由細(xì)胞支架蛋白Axin、GSK-3β、腺瘤樣結(jié)腸息肉病基因（adenomatous polyposis coli，APC）編碼的蛋白組成的降解復(fù)合體對(duì)β-catenin的磷酸化，避免其降解，讓?duì)?catenin在細(xì)胞質(zhì)中穩(wěn)定積累，隨后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)激活轉(zhuǎn)錄因子（T-cell-specific transcription factor，TCF）/淋巴增強(qiáng)因子（lymphoid enhancing factor，LEF），形成 β-catenin-TCF/LEF 二聚體，從而激活下游靶基因如AKP轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，此時(shí)信號(hào)通路被激活［7］。

氯化鋰是被廣泛應(yīng)用的GSK-3β無(wú)機(jī)離子抑制劑，能通過(guò)抑制鉀的丟失或者與鎂競(jìng)爭(zhēng)，使絲氨酸N端結(jié)構(gòu)域被磷酸化，抑制 GSK3β 的活性［8］，阻止Axin-APC-GSK-3β降解復(fù)合體的形成，促使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量聚集從而激活通路［7］。氯化鋰能通過(guò)經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系細(xì)胞和人骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖［6，9］。本研究顯示氯化鋰對(duì)增殖的影響是具有劑量依賴(lài)性的，ADSCs在2.5～10 mmol/L濃度作用時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖，而作用的濃度升高時(shí)（20、40 mmol/L）對(duì)細(xì)胞具有毒性，抑制增殖。40 mmol/L時(shí)細(xì)胞不僅增殖緩慢，形態(tài)也發(fā)生變化，不是呈長(zhǎng)梭形而是向周?chē)煺?，并且變得較扁平，細(xì)胞之間接觸松散不緊密。說(shuō)明可以選擇2.5～10 mmol/L的氯化鋰，對(duì)脂肪干細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。

AKP是早期成骨分化的特異性標(biāo)志物［10］。AKP活性檢測(cè)結(jié)果表明5、10 mmol/L氯化鋰能夠有效提高細(xì)胞AKP的活性。早期研究［11］顯示在小鼠多能干細(xì)胞系C3H10T1/2細(xì)胞中，氯化鋰能通過(guò)活化內(nèi)源性的 β-catenin或者異位表達(dá)穩(wěn)定的βcatenin來(lái)激活 Wnt/β-catenin信號(hào)通路，誘導(dǎo) AKP mRNA的表達(dá)，在成骨前體細(xì)胞和成骨細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮作用。在大鼠和人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中也能促進(jìn)細(xì)胞成骨向分化［12－13］。Han et al［10］使用氯化鋰活化Wnt/β-catenin信號(hào)通路能促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞中AKP、OPN基因的表達(dá)。根據(jù)這些研究結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選擇氯化鋰作為有效激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活劑，來(lái)觀察不同濃度氯化鋰對(duì)大鼠ADSCs成骨向分化的作用。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著氯化鋰濃度增高，GSK-3β的mRNA表達(dá)量逐漸減少，β-catenin的mRNA表達(dá)量增加，說(shuō)明氯化鋰有效抑制了GSK-3β對(duì)于β-catenin的磷酸化，激活了Wnt/β-catenin信號(hào)通路。AKP的表達(dá)在5 mmol/L組最高，隨后依次減少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明氯化鋰有效作用于Wnt/β-catenin信號(hào)通路，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)并且具有劑量依賴(lài)性，可能由于氯化鋰對(duì)GSK-3β具有雙重抑制的作用而影響信號(hào)通路的激活，適當(dāng)?shù)牟糠忠种艷SK-3β是有益處的，但是大量抑制其功能可能是具有毒性的［8，14］。

綜上所述，氯化鋰作為經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活劑，在ADSCs增殖和成骨向分化中起到重要作用，5 mmol/L的氯化鋰可以作為同時(shí)促進(jìn)ADSCs增殖和成骨向分化的適宜濃度，為今后牙周組織工程中骨再生研究提供了依據(jù)，但其作用的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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Effect of Lithium chloride mediated canonical Wnt/β-catenin signaling on proliferation and osteogenic differentiation of rat adiposed-derived stem cells

Zhao Xuan，Xu Yan，Zheng Guiting，et al
（Dept of Periodontal Oral Medicine，Stomatologic Hospital of Anhui Medical University，Key Lab of Oral Diseases Research of Anhui Province，Hefei230032）

ObjectiveTo investigate the effect of different concentrations of Lithium chloride on proliferation and osteogenic differentiation of rat adiposed-derived stem cell（ADSCs）in vitroculture and its possible mechanism.Methods① The ADSCs were harvested from the fat pad in the groin of 3-week-old rats，then maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10%fetal bovine serum after digesting with 0.1%collagenase type Ⅰ.ADSCs were exposed to Lithium chloride at 0，2.5，5，10，20，40 mmol/L for 24，48 and 72 hours.The effect of Lithium chloride on cells proliferation was determined by MTT assay.② Alkaline phosphatase（AKP）activity in cells was detected after ADSCs cultured for 7 days in osteogenic differentiation medium in 2.5，5，10，20，40 mmol/L or with no Lithium chloride.③ The ADSCs were treated with different concentrations of Lithium chloride for 7 days after treating with osteogenic differentiation medium for 3 days，and the expressions of β-catenin，glycogen synthase kinase-3β，AKP were detected by using RT-PCR method.ResultsIn vitro，low doses of Lithium chloride（2.5，5 and 10 mmol/L）sitimulated ADSCs proliferation，whereas high doses caused a inhibition of proliferation.5 and 10 mmol/L Lithium chloride induce AKP activity in ADSCs which were induced the differentiation towards osteolasts，however 40 mmol/L significantly inhibited AKP activity.Meanwhile，Lithium chloride upregulated the expression of β-catenin and AKP.ConclusionIn vitro，Lithium chloride has a dual effect on ADSCs proliferation，and it improves AKP activity as well as promoting osteogenic differentiation in a dose-dependent manner.5 mmol/L Lithium chloride can be used as the optimum concentration for stimulating cell proliferation and promoting osteogenic differentiation in rat ADSCs.

Wnt/β-catenin signaling pathway;adiposed-derived stem cell;Lithium chloride;proliferation;osteogenic differentiation

R 781.4

A

1000－1492（2014）05－0590－05

2014－01－05接收

安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào):1308085MH130）

1安徽醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，安徽醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省口腔醫(yī)院牙周黏膜科，安徽省口腔疾病研究中心實(shí)驗(yàn)室，合肥 230032

2安徽省病原生物學(xué)省級(jí)實(shí)驗(yàn)室和人獸共患病安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230032

趙 璇，女，碩士研究生;

徐 燕，女，教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail:173236344@qq.com