HPLC法同時(shí)測(cè)定偏癱口服液中阿魏酸與丹酚酸B的含量

廣西壯族自治區(qū)柳州食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 柳州 545006

HPLC法同時(shí)測(cè)定偏癱口服液中阿魏酸與丹酚酸B的含量

蔣秋香吳柳春韋永樸

廣西壯族自治區(qū)柳州食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 柳州 545006

目的利用雙波長(zhǎng)高效液相色譜法，建立偏癱口服液中阿魏酸、丹酚酸B的含量測(cè)定方法。方法采用雙波長(zhǎng)HPLC法，Waters SunFire C18(4.6mm(250mm，5μm)色譜柱，柱溫35℃；甲醇-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，以1.0mL·min-1流速梯度洗脫；阿魏酸檢測(cè)波長(zhǎng)為318nm、丹酚酸B檢測(cè)波長(zhǎng)為286nm。結(jié)果：根據(jù)回歸方程，阿魏酸和丹酚酸B的線性范圍分別為6.152～76.9μg(r=0.9998)、294.8～3685.0μg(r=1.0000)；加樣回收率分別為99.7%(n=6)、 98.2%(n=6)。結(jié)論：本方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可有效地提高該制劑的內(nèi)在質(zhì)量，也為該藥品標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步研究，提供一個(gè)準(zhǔn)確的參考方法。

HPLC；梯度洗脫法；偏癱口服液；阿魏酸；丹酚酸B

偏癱口服液由地龍、丹參、紅花、川芎、王不留行和甘草六味中藥組成，具有活血、驅(qū)風(fēng)通絡(luò)的作用，是廣西柳州市中醫(yī)院用于治療偏癱的常用院內(nèi)制劑?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)比較簡(jiǎn)單，僅檢查藥品性狀、鑒別、相對(duì)密度及pH值等，無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)目。方中丹參和川芎屬活血化瘀藥，丹參具有活血祛瘀，養(yǎng)血安神，涼血消腫的功效[1]，現(xiàn)代藥理研究其具有抗血栓、改善微循環(huán)、促進(jìn)組織的修復(fù)與再生等作用[2]；川芎具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效[1]，現(xiàn)代藥理研究其具有擴(kuò)張血管、抗血栓、改善微循環(huán)等作用[3]。為此，以方中丹參有效成分丹酚酸B、川芎有效成分阿魏酸為指標(biāo)成分，針對(duì)其不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，首次采用多波長(zhǎng)高效液相色譜法，同時(shí)檢測(cè)阿魏酸、丹酚酸B的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀，2487型紫外檢測(cè)器，Empower Pro工作站(Waters公司)；UV-2450紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；METTLER XS205電子分析天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2 試藥 對(duì)照品阿魏酸(批號(hào)：110773-200611)、丹酚酸B(批號(hào)：110861-200808)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。偏癱口服液樣品3批(規(guī)格為10ml/瓶，批號(hào)20101129；20101223；20110228)，由廣西柳州市中醫(yī)院制劑室提供，陰性樣品按偏癱口服液處方比例自配。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters SunFire C18(4.6 mm(250 mm，5 μm)，柱溫35℃；以甲醇(A)和0.1%磷酸溶液(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫。0～22min甲醇的比例為30%；22～25min甲醇的比例為30%～40%；25～53min甲醇的比例為40%。流速1.0ml·min-1；阿魏酸檢、丹酚酸B檢測(cè)波長(zhǎng)為分別318nm(0～30min)、286nm(30～53min)；進(jìn)樣量為10μl。按上述實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果理論板數(shù)以2種指標(biāo)成分(阿魏酸、丹酚酸B)計(jì)均不低于5000，且2種成分都能達(dá)到基線分離，分離度大于1.5。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液制備 分別取對(duì)照品阿魏酸、丹酚酸B適量，精密稱定，加甲醇制成含阿魏酸0.003mg·ml-1、丹酚酸B 0.15mg·ml-1的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取偏癱口服液樣品過(guò)0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性供試品溶液 取缺川芎的陰性樣品和缺丹參的陰性樣品，分別過(guò)0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn) 分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性供試品溶液各10μl，按上述色譜條件進(jìn)樣，液相色譜圖見(jiàn)圖1。陰性樣品在阿魏酸、丹酚酸B的色譜峰位置上無(wú)吸收，表明該方法的專屬性良好。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2、5、10、15、20、25μL進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以峰面積Y對(duì)進(jìn)樣量X(μg)進(jìn)行線性回歸，求得阿魏酸和丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 阿魏酸和丹酚酸B的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μl，以阿魏酸、丹酚酸B峰面積計(jì)，RSD分別為0.9%，1.5%。表明該方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，室溫下分別于0、2、8、12、20、24h進(jìn)樣測(cè)定，考察阿魏酸、丹酚酸B在室溫下的溶液穩(wěn)定性，記錄色譜圖，以峰面積進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果RSD分別為1.0%、2.2%。表明供試品溶液室溫放置24h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品各6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10μl，測(cè)定。結(jié)果樣品中阿魏酸和丹酚酸B平均含量(n=6)分別為2.635μg·ml-1，128.8μg·ml-1；RSD分別為1.2%，1.5%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn) 精密吸取“2.7”項(xiàng)下已知阿魏酸、丹酚酸B含量的樣品5ml共6份，分別精密加入“2.2.1項(xiàng)下的對(duì)照品混合溶液(阿魏酸3.076μg·ml-1、丹酚酸B147.4μg·ml-1)5ml，按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，制備供試溶液，測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果阿魏酸和丹酚酸B的平均回收率(n=6)分別為99.7%(RSD=1.6%)，98.2%(RSD=0.9%)。

2.9 樣品含量測(cè)定 分別取3個(gè)批號(hào)的偏癱口服液樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液及混合對(duì)照品溶液各10μl，注入液相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 偏癱口服液中阿魏酸和丹酚酸B的含量(μg·ml-1)

4 討論

4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 經(jīng)紫外分光光度計(jì)掃描波長(zhǎng)，阿魏酸、丹酚酸B分別在318nm、286nm處有最大吸收，與2010年版中國(guó)藥典一部川芎(阿魏酸)、丹參(丹酚酸B)的含量測(cè)定檢測(cè)波長(zhǎng)分別為321nm、286nm相符合。在試驗(yàn)中選擇同時(shí)兼顧到2個(gè)被測(cè)成分在某單一波長(zhǎng)下檢測(cè)，結(jié)果大大降低了被測(cè)成分的檢測(cè)靈敏度，甚至造成被測(cè)成分未檢出的后果。故本文采用多波長(zhǎng)測(cè)定法，分別在各被測(cè)成分紫外最大吸收波長(zhǎng)處同時(shí)進(jìn)行含量檢測(cè)。這樣既提高了檢測(cè)靈敏度，又為測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠提供保障。

4.2 流動(dòng)相的選擇 參考中國(guó)藥典及文獻(xiàn)資料[4-5]，綜合幾種流動(dòng)相方法分析，得出本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相條件。結(jié)果表明采用本實(shí)驗(yàn)所采用的梯度洗脫方法，能較好的分離有效成分，且分離時(shí)間短，峰形好。

4.3 供試品溶液的制備 樣品無(wú)需任何前處理，直接過(guò)濾膜即可進(jìn)樣分析。既操作簡(jiǎn)便，利于生產(chǎn)廠家半成品及成品快速檢測(cè)，又消除了分析環(huán)節(jié)的一大誤差因素。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M]：2010年版一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2] 羅彩蓮.丹參的藥理作用與臨床應(yīng)用[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2012，19(12)：11-12.

[3] 裴艷霞.川芎的藥理作用及臨床應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2011，9(34)：197-198.

[4] 劉建明，郭詠梅，周娟麗.HPLC法測(cè)定新生化顆粒中阿魏酸的含量[J].宜春學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，3(4)：111-112.

[5] 于晶晶，徐飛鶴.RP-HPLC同時(shí)測(cè)定香丹注射液中丹參素鈉、原兒茶醛和丹酚酸B的含量[J].海峽藥學(xué)，2012，2(2)：45-47.

HPLCwithdual-wavelengthsimultaneousdeterminationoftwoeffectiveingredientsinPiantanoralliquidbygradientelution

JIANG Qiu-xiang WU Liu-chun Wei Yong-pu

Guangxi Liuzhou Institate for Food and Drug Control,Liuzhou 545006,China

To establish an HPLC with dual-wavelength detection method for simultaneous determination of Ferulic acid and Salvianolic acid B in Piantan oral liquid.MethodsThe quantitative analysis was carried out on a column of Waters SunFire C18(4.6 mm×250 mm,5 μm) by HPLC with dual-wavelength , by a gradient elution using methanol(A) and water(B) as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL·min-1at 35 ℃;The eluate was detected by multiple wavelength: 318 nm for Ferulic acid (0～30min),286 nm for Salvianolic acid B (30～50 min).ResultsThe linear ranges of Ferulic acid and Salvianolic acid B fell within the ranges of 6.152～76.9μg(r=0.9998) and 294.8～3685.0μg(r=1.0000); The average recoveries were 99.7%(n=6) for Ferulic acid and 98.2%( n=6) for Salvianolic acid B.ConclusionThis method is simple, accurate, reliable and can be use to improve inner quality,also provides a reference standard for the quality control of Piantan oral liquid.

Piantan oral liquid; Ferulic acid; Salvianolic acid B

蔣秋香(1983-) 女，漢族，廣西全州人 ，主管中藥師，主要從事藥品、食品、化妝品、保健食品的檢驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail：67370082@QQ.com

R284.1

A

1007-8517(2014)01-0007-03

2013.11.15)