頂空氣相色譜法測定注射用甲磺酸吉米沙星中基因毒性雜質(zhì)

范達(dá)，涂家生

（中國藥科大學(xué)藥劑學(xué)教研室，江蘇 南京210000）

頂空氣相色譜法測定注射用甲磺酸吉米沙星中基因毒性雜質(zhì)

范達(dá)，涂家生*

（中國藥科大學(xué)藥劑學(xué)教研室，江蘇 南京210000）

目的：建立測定注射用甲磺酸吉米沙星中甲磺酸烷基酯類基因毒性雜質(zhì)的頂空氣相色譜法。方法：以Supelco毛細(xì)管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）為色譜柱，程序升溫；氮氣為載氣，流速為0.5 mL?min-1；采用微池電子捕獲檢測器，檢測器溫度為250 ℃；頂空進(jìn)樣，平衡溫度為60 ℃，平衡時間為30 min，進(jìn)樣口溫度為110 ℃,進(jìn)樣量為1 mL；分流比為1∶10。 結(jié)果：基因毒性雜質(zhì)甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯和甲磺酸異丙酯在限度為20%～120%的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量限分別為0.010 0、0.250 0和1.250 0 μg?L-1，檢測限分別為0.002 0、0.010 0和0.250 0 μg?L-1，平均回收率分別為99.20%、99.45%和99.98%（n=9）。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、簡便，適用于甲磺酸吉米沙星中基因毒性雜質(zhì)的檢測及限度控制。

頂空氣相色譜法；甲磺酸吉米沙星；基因毒性雜質(zhì)

甲磺酸吉米沙星（gemifloxacin mesylate）是由韓國LG Life Sciences公司開發(fā)的第4代氟喹諾酮類抗菌素，具有強效廣譜抗菌活性，2006 年7月在我國獲準(zhǔn)上市。目前國內(nèi)外上市的甲磺酸吉米沙星均為片劑，而對于一些重癥病人、住院病人或腸胃道吸收有障礙的病人來說，該藥僅有片劑是不夠的，開發(fā)其注射劑型非常必要。但注射劑型對雜質(zhì)要求更加嚴(yán)格，因此，需建立對注射用甲磺酸吉米沙星中潛在基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行測定再評估的有效方法。

甲磺酸鹽藥物中可能含有甲磺酸烷基酯類的基因毒性雜質(zhì)，其來源是合成時低級醇和甲磺酸發(fā)生反應(yīng)而生成的甲磺酸甲酯（MMS）、甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸異丙酯(IMS)等[1]，這些甲磺酸酯的DNA 烷基化作用會產(chǎn)生誘變效應(yīng)、致癌效應(yīng)和致畸效應(yīng)[2]。為了防止類似甲磺酸奈非那韋不良事件的發(fā)生，歐洲藥品管理局（EMEA）在2008年發(fā)布了要求生產(chǎn)企業(yè)對所有甲磺酸鹽類產(chǎn)品進(jìn)行基因毒性雜質(zhì)再評估并出示“生產(chǎn)聲明”的函件，其中指出，對于無足夠證據(jù)證明其基因毒性閾值的化合物，可根據(jù)毒理學(xué)關(guān)注閾值（threshold of toxicological concern，TTC）來設(shè)定限度，經(jīng)評價，基因毒性化合物的TTC值即每人攝入限量應(yīng)為1.5 μg·d-1[3]。注射用甲磺酸吉米沙星的人體攝取量一般為260 mg·d-1，根據(jù)TTC值可限定其中所含甲磺酸烷基酯類基因毒性雜質(zhì)總量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）不得超過5×10-6。本文在參考?xì)W洲藥典7.5版“2.5.38”衍生化法的基礎(chǔ)上，以氮氣為載氣，采用頂空氣相色譜（GC）法測定注射用甲磺酸吉米沙星中MMS、EMS和IMS的含量。

1 儀器與試藥

Agilent 7890A 氣相色譜儀；Agilent ChemStation 化學(xué)工作站；HG-1083A型高純氮氣發(fā)生器（北京科普生分析科技有限公司）；BP211D型電子天平（Sartorius公司）。

MMS對照品（J&K公司，批號：LA90M69，純度：99%）；EMS對照品（純度：99%，Aladdin公司，批號：C1329031）； IMS對照品（純度：97%，蘇州亞科化學(xué)試劑股份有限公司，批號：YK2013060501）；甲磺酸正丁酯（BMS）標(biāo)準(zhǔn)品（蘇州亞科化學(xué)試劑股份有限公司，批號：YK2013061801）；甲磺酸吉米沙星原料藥樣品（LG Life Sciences公司，批號：QVB06004）；注射用甲磺酸吉米沙星樣品（麗珠醫(yī)藥集團，批號：070501、070601、110101）；乙腈為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Supelco毛細(xì)管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；載氣：氮氣；流速：0.5 mL·min-1；柱升溫程序：先以10 ℃·min-1由40 ℃升至110 ℃，再以50 ℃·min-1升至240 ℃；檢測器：微池電子捕獲檢測器（uECD），溫度為250 ℃；頂空進(jìn)樣：頂空平衡溫度為60 ℃，平衡時間為30 min，進(jìn)樣口溫度為110 ℃，進(jìn)樣量為1 mL；分流比：1:10。

2.2 溶液配制

溶液A：取碘化鈉60.0 g和無水硫代硫酸鈉30 mg，加水溶解并稀釋至50 mL，即可。

內(nèi)標(biāo)液：取25 μL BMS標(biāo)準(zhǔn)品溶于水-乙腈（20:80）混合溶劑中，并定容至25 mL；吸取該溶液50 μL，用混合溶劑稀釋至10 mL，再吸取1 mL，稀釋至25 mL，即可。

對照品儲備液：精密稱取MMS、EMS和IMS對照品各25 mg，加入甲苯使溶解并定容至5 mL；取該溶液50 μL，用內(nèi)標(biāo)液定容至25 mL，即可。

對照品溶液：吸取對照品儲備溶液625 μL，用內(nèi)標(biāo)液稀釋至25 mL；吸取該溶液和溶液A各0.5 mL，置20 mL頂空瓶中，立即壓蓋（覆膜膠塞和鋁蓋），即可。

供試品溶液：精密稱取樣品25.0 mg，置頂空瓶中，加入溶液A和內(nèi)標(biāo)液各0.5 mL，立即壓蓋，即可。

2.3 方法專屬性考察以及雜質(zhì)含量測定方法與限度

取平衡后的對照品溶液和空白溶劑（水-乙腈混合溶劑）頂空瓶內(nèi)氣體各1 mL，按“2.1”項下色譜條件，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖（見圖1）。由圖1可見，各雜質(zhì)峰分離良好，空白溶劑對各雜質(zhì)的檢測無影響。依據(jù)色譜圖，樣品中各雜質(zhì)含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的計算公式為：A2×I1×W1×G×0.05×10-6/（A1×I2×W2），其中A1為對照品溶液中某雜質(zhì)峰面積，A2為供試品溶液中某雜質(zhì)峰面積，G為某雜質(zhì)對照品純度，I1為對照品溶液中內(nèi)標(biāo)峰面積，I2為供試品溶液中內(nèi)標(biāo)峰面積，W1為對照品儲備液中某雜質(zhì)對照品質(zhì)量，W2為供試品溶液中樣品質(zhì)量。供試品溶液色譜圖中若有雜質(zhì)峰，各雜質(zhì)峰面積不得大于對照品溶液中相應(yīng)雜質(zhì)峰面積，且按上式計算的各雜質(zhì)含量的總量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）不得超過5×10-6。

圖1 專屬性實驗色譜圖Figure 1 Chromatograms from specificity test

2.4 線性考察

分別精密量取對照品儲備液125、250、375、500、625和725 μL 置25 mL容量瓶中，加內(nèi)標(biāo)液定容至刻度，搖勻，制成檢測限度為20%、40% 、60%、80%、100%和120%的對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件，進(jìn)樣，記錄色譜圖。

以對照品溶液質(zhì)量濃度（C，mg·L-1）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制MMS、EMS和IMS的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別獲得其線性回歸方程：

結(jié)果表明，MMS、EMS和IMS在限度為20%～120%的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 檢測限和定量限

取對照品溶液，加內(nèi)標(biāo)液逐級稀釋成不同質(zhì)量濃度，按“2.1”項下色譜條件，進(jìn)樣檢測。結(jié)果，在信噪比約為10時，測得MMS、EMS和IMS的定量限分別為0.010 0、0.250 0和1.250 0 μg·L-1；在信噪比約為3時，測得MMS、EMS和IMS的檢測限分別為0.002 0、0.010 0和0.250 0 μg·L-1。

2.6 精密度

取對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果，測得MMS、EMS和IMS峰面積的RSD分別為4.78%、3.89%和3.63%（n=6）。

2.7 重復(fù)性

按“2.2”項下方法，精密稱取注射用甲磺酸吉米沙星樣品（批號：110101）25 mg，配制供試品溶液，平行6份，并按“2.1”項下色譜條件，進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖。結(jié)果，測得MMS和EMS峰面積的RSD分別為4.49%和3.77%（n=6），但I(xiàn)MS未檢出。

2.8 回收率

分別精密量取對照品儲備液500、625和725 μL 置25 mL容量瓶中，加內(nèi)標(biāo)液定容至刻度，搖勻，制成檢測限度為80%、100%和120%的對照溶液。精密稱取注射用甲磺酸吉米沙星樣品（批號：110101）25.0 mg，至20 mL頂空瓶中，加入溶劑A 0.5 mL，內(nèi)標(biāo)液0.5 mL，立即壓蓋，作為樣品本底溶液。另取9份25.0 mg注射用甲磺酸吉米沙星樣品（批號：110101），精密稱定，置頂空瓶中，分成3組（每組3份），分別加入檢測限度為80%、100%及120%的對照溶液0.5 mL，并各加入溶劑A 0.5 mL，密封，作為供試品溶液。此外，再按“2.2”項下要求配制對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件，將樣品本底溶液、供試品溶液和對照品溶液分別進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖。按“2.3”項下公式計算樣品本底溶液和供試品溶液中各雜質(zhì)含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），分別記做已知量和測得量，而各供試品溶液中加入的對照溶液所含各雜質(zhì)含量記做加入量，最后按公式計算回收率：回收率=[（測得量－已知量）/加入量]×100%。結(jié)果測得，MMS、EMS和IMS的平均回收率分別為99.20%、99.45%和99.98%，RSD分別為4.00%、3.84%和3.99%（n=9）。

2.9 樣品測定

分別精密稱取原料藥和各批次注射用甲磺酸吉米沙星樣品以及各雜質(zhì)對照品，按“2.2”項下方法，配制供試品溶液以及對照品溶液，并按“2.1”項下色譜條件，進(jìn)樣檢測，再按“2.3”項下公式，計算樣品中各雜質(zhì)含量，結(jié)果見表1。

表1 各樣品中基因毒性雜質(zhì)的測定結(jié)果Table 1 Determination results of genotoxic impurities in different samples

由表1可見，各甲磺酸吉米沙星樣品中均存在MMS和EMS，而IMS未檢出，雜質(zhì)總量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）都小于5×10-6，符合限度要求。

3 討論

甲磺酸吉米沙星除了其原料在合成過程中可能因使用甲醇、乙醇等低級醇類而產(chǎn)生并引入MMS、EMS等基因毒性雜質(zhì)外，其在制劑過程也可能是因生產(chǎn)設(shè)備曾用甲醇等低級醇清洗而將殘留溶劑引入，導(dǎo)致制劑中基因毒性雜質(zhì)增多，而且隨著制劑放置時間的增長，其中基因毒性雜質(zhì)含量還會逐漸增加，這可能是其間殘留溶劑與甲磺酸不斷發(fā)生反應(yīng)而生成基因毒性雜質(zhì)所致。本文中，甲磺酸吉米沙星注射制劑放置6年的批號070501和070601樣品中基因毒性雜質(zhì)含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）比放置2年的批號110101樣品高約6×10-8，不過總量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）也僅約為1.7×10-7，仍遠(yuǎn)小于雜質(zhì)限度5×10-6，即所有制劑樣品中的基因毒性雜質(zhì)含量都在限度范圍內(nèi)。為了避免甲磺酸烷基酯類雜質(zhì)的產(chǎn)生，從根本上杜絕基因毒性物質(zhì)引起的風(fēng)險，藥物活性成分的生產(chǎn)及生產(chǎn)設(shè)備的清洗過程應(yīng)盡量避免使用低級脂肪醇。

本文所建立的頂空GC法能有效檢測出甲磺酸吉米沙星原料及注射制劑中各基因毒性雜質(zhì)，且經(jīng)濟、便捷，適用于該藥中基因毒性雜質(zhì)的檢測及限度控制。

[1]Sitaram C, Rupakula R B. Determination of alkyl methanesulfonates in doxazosin mesylate by gas chromatography-mass spectrometer [J]. Indian J Pharm Sci, 2011, 73(1): 107-110.

[2]García A, Rupérez F J, Ceppa F, et al. Development of chromatographic methods for the determination of genotoxic impurities in cloperastine fendizoate [J]. J Pharm Biomed Anal, 2012, 61: 230-236.

[3]European Medicines Agency. Evaluation of medicines for human use, guideline on the limits of genotoxic impurities[EB/OL].[2014-01-27]. http://www.rsihata.com/updateguidance/emea/old/519902en.pdf.

Determination of Genotoxic Impurities in Gemifoxacin Mesylate for Injection by Head-space GC

FAN Da, TU Jiasheng
(Department of Pharmaceutics, China Pharmaceutical University, Nanjing 210000,China)

Objective: To establish a head-space GC method for the determination of the genotoxic impurities in gemifoxacin mesylate for injection. Methods: A Supelco capillary column (30 m×250 μm，0.25 μm) (temperature programming), nitrogen as carrier gas (fow rate: 0.5 mL?min-1) and uECD(temperature: 250 ℃) were used . H-space sampling was conducted (equilibrium temperature: 60 ℃, equilibrium time: 30 min, injection port temperature: 110 ℃, injection volume: 1 mL ) with a split ratio of 1:10. Results: The genotoxic impurities, methyl methanesulfonate, ethyl methanesulfonate and isopropyl methanesulfonate showed good linear relationships in the limitation range of 20%-120%.Their LOQs were 0.010 0, 0.250 0 and 1.250 0 μg?L-1respectively. Their LODs were 0.002 0, 0.010 0, 0.250 0 μg?L-1respectively. Their average recoveries were 99.20%, 99.45% and 99.98%(n=9). Conclusion: The method is accurate and convenient. It is suitable for the determination and limitation control of the genotoxic impurities in gemifoxacin mesylate.

head-space GC; gemifoxacin mesylate; genotoxic impurity

O657.71

B

1001-5094(2014)03-0220-04

接受日期：2013-12-23

*通訊作者：涂家生，教授；

研究方向：藥物新劑型與新技術(shù)；

Tel：025-83271305；E-mail：jiashengtu@yahoo.com.cn