免疫培養(yǎng)-凝集法快速檢出痢疾桿菌的試驗(yàn)

徐飛

1、湖南省腦科醫(yī)院 湖南 長(zhǎng)沙 410007

2、湖南省疾病預(yù)防控制中心 湖南 長(zhǎng)沙 410005

3、慈利縣疾病預(yù)防控制中心 湖南 慈利 427200

免疫培養(yǎng)-凝集法快速檢出痢疾桿菌的試驗(yàn)

徐飛1李劍2王鵬3

1、湖南省腦科醫(yī)院 湖南 長(zhǎng)沙 410007

2、湖南省疾病預(yù)防控制中心 湖南 長(zhǎng)沙 410005

3、慈利縣疾病預(yù)防控制中心 湖南 慈利 427200

目的：建立免疫培養(yǎng)-凝集法的快速檢出痢疾桿菌方法，為疫情流行病學(xué)調(diào)查處理和病人早期診斷治療提供病原學(xué)依據(jù)。方法將經(jīng)大腸桿菌吸附后的福氏和宋內(nèi)氏混合抗血清加入GN增菌肉湯培養(yǎng)液中，混勻后滴加于玻片凹處，再將離心沉淀后的糞便樣品上清液接種于該培養(yǎng)液中，放入濕盒37℃培養(yǎng)4～6h，取出并肉眼觀察玻片凹處培養(yǎng)液中的凝集菌團(tuán)，凡發(fā)現(xiàn)一個(gè)凝集菌團(tuán)即為陽(yáng)性。每份樣品以常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法做平行試驗(yàn)。吸取凝集菌團(tuán)并以細(xì)菌培養(yǎng)法進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果共檢測(cè)111份菌痢和腹瀉病人糞便樣品，免疫培養(yǎng)-凝集法檢出陽(yáng)性41份，檢出率為36.9%，與細(xì)菌培養(yǎng)法檢出陽(yáng)性的符合率達(dá)89.2%，兩種檢測(cè)方法的一致性為優(yōu)(Kappa=0.763)。凝集菌團(tuán)被證實(shí)為痢疾桿菌占82.9%。結(jié)論免疫培養(yǎng)-凝集法具有操作簡(jiǎn)便、快速、特異性好和敏感性高的優(yōu)點(diǎn)，在疫情調(diào)查處理和病人的早期診斷治療中具有一定意義。

免疫培養(yǎng)-凝集法；細(xì)菌培養(yǎng)；痢疾桿菌

細(xì)菌性痢疾是常見(jiàn)多發(fā)傳染病，在聚集人群中常出現(xiàn)暴發(fā)和流行，因此快速檢出病原菌對(duì)控制疫情和早期診斷治療病人具有十分重要意義。本文采用免疫培養(yǎng)-凝集法，在實(shí)驗(yàn)室研究的基礎(chǔ)上，檢測(cè)111份菌痢病人和非菌痢病人糞便樣品，現(xiàn)將方法和結(jié)果報(bào)告如下：

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 菌種：F1a、F2a、F3a、F4a、F5、F6型福氏痢疾桿菌和宋內(nèi)型痢疾桿菌，來(lái)自湖南省疾病預(yù)防控制中心和慈利縣疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)室保存的菌株。

1.2 抗痢疾桿菌免疫血清的制備：按文獻(xiàn)[1]用家兔分別制得F1a、F2a、F3a、F4a、F5、F6型和宋內(nèi)氏七個(gè)型的免疫血清。試管凝集效價(jià)F1-F6均為1：3200，宋內(nèi)氏為1：6400。用4株大腸桿菌(正常人糞便中分離出)的混合菌液(>30億/ml)吸收2次，除去非特異性抗體，吸收后特異抗體效價(jià)為1:1200，實(shí)驗(yàn)時(shí)用稀釋度為1:20。

1.3 GN增菌肉湯培養(yǎng)液、甘油緩沖鹽水保菌液和SS培養(yǎng)基按常規(guī)法配制。

1.4 糞便標(biāo)本：來(lái)自慈利縣疾病預(yù)防控制中心、慈利縣中醫(yī)院門診和住院病人，取糞便約1g，保存在甘油緩沖鹽水保菌液中。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 糞便標(biāo)本處理：已加入糞便的甘油緩沖鹽水保菌液，混合后1000rpm離心10分鐘，上清液作檢驗(yàn)樣品。

2.2 被吸收后的抗血清用GN增菌肉湯1:20稀釋，取2滴加于載玻片兩端的凹窩，取被檢樣品上清液1接種環(huán)于左側(cè)混勻，再?gòu)闹腥∫画h(huán)于右側(cè)混勻，置塘瓷溫盒中37℃培養(yǎng)4～6小時(shí)后，取出肉眼觀察結(jié)果，有1個(gè)以上灰白色絮狀圓形凝集菌團(tuán)為陽(yáng)性，無(wú)凝集菌團(tuán)為陰性。

2.3 病人糞便樣品同時(shí)以常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法作平行試驗(yàn)，以F2a和宋內(nèi)氏菌株作陽(yáng)性對(duì)照，并設(shè)陰性對(duì)照。

2.4 用微量注射器吸取凝集菌團(tuán)，放入SS平皿中，用接種環(huán)劃線，37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)后，按常規(guī)法分離鑒定。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 免疫培養(yǎng)-凝集法和細(xì)菌培養(yǎng)法同時(shí)檢測(cè)111份菌痢病人和腹瀉病人糞便樣品，免疫培養(yǎng)-凝集法的檢出率為36.9%，與常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法的檢出率33.3%沒(méi)有差別(P=0.388)，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 兩種檢測(cè)方法一致的檢出率為29.7%，以細(xì)菌培養(yǎng)法陽(yáng)性樣本為參考，兩種檢測(cè)方法檢出符合率達(dá)89.2%。兩種檢測(cè)方法一致性為優(yōu)(Kappa=0.763, P<0.001)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 免疫培養(yǎng)-凝集法與細(xì)菌培養(yǎng)法檢出痢疾桿菌結(jié)果

3.3 對(duì)41份免疫培養(yǎng)-凝集法陽(yáng)性樣品的凝集菌團(tuán)進(jìn)行純培養(yǎng)鑒定，有34份被證實(shí)為痢疾桿菌占82.9%，其菌型與細(xì)菌培養(yǎng)一致，結(jié)果表明免疫培養(yǎng)-凝集法的檢出結(jié)果是可靠的。

4 討論

免疫培養(yǎng)-凝集法是將傳統(tǒng)的細(xì)菌增菌培養(yǎng)與抗血清的凝集反應(yīng)進(jìn)行有機(jī)的結(jié)合，使痢疾桿菌在含有相應(yīng)抗血清的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的同時(shí)又不斷的與相應(yīng)抗體結(jié)合，進(jìn)而成凝集性生長(zhǎng)繁殖，可形成直徑在100μm左右的灰白色特異性凝集菌團(tuán)[2]，肉眼很容易觀察到，從而使該方法具有操作簡(jiǎn)便、快速、特異性好、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)。

有4份常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法陽(yáng)性的樣品，而免疫培養(yǎng)-凝集法則為陰性。這表明該方法存在病例診斷時(shí)的漏診現(xiàn)象。造成的原因，一是這4份樣品中有1份細(xì)菌培養(yǎng)法檢出為痢疾志賀氏菌，不屬免疫培養(yǎng)-凝集法使用的混合特異性抗血清檢測(cè)范圍所致。二是另有2份樣品常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法檢出為未定型株，說(shuō)明痢疾桿菌的抗原性變異亦是該方法漏診的原因之一[3]。這方面有待進(jìn)一步研究。

該方法使用的抗血清需經(jīng)腸道菌吸附，以除去其它腸道菌的非特異性抗原[1]，另外GN增菌肉湯培養(yǎng)液，既有增菌培養(yǎng)作用，又有抑制糞便中其它腸道菌生長(zhǎng)的使用[4]，以及接種時(shí)取經(jīng)離心沉淀處理的上清液糞便樣品，這些都是減少非特異反應(yīng)的措施。

免疫培養(yǎng)-凝集法與細(xì)菌培養(yǎng)法具有很好的檢出一致性，檢出陽(yáng)性時(shí)間只需4～6小時(shí)，克服了常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)，具有快速檢出特點(diǎn)，對(duì)疫情的處理和病人的診斷治療都有重要意義。

[1]上海市衛(wèi)生防疫站．衛(wèi)生防疫檢驗(yàn)：細(xì)菌檢驗(yàn)[M]．上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979，23-35．

[2]魯開(kāi)國(guó)，陶秀蓮，生菊，等．免疫微菌落染色法快速診斷霍亂弧菌研究[J]．中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，1994，4：202-204．

[3]張卓然，倪語(yǔ)星．臨床微生物學(xué)和微生物檢驗(yàn)[M]．3版，北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：119．

[4] 胡小玲，沈永芳．沙門-志賀菌增菌培養(yǎng)基的研究[J]．實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2006，13(4)：1025-1026．

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1009-6019(2014)08-0248-01