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    皖南地區(qū)常見松針抑菌效果研究

    2014-09-04 08:07:37翁澤斌顏翠萍李偉東
    荊楚理工學(xué)院學(xué)報 2014年4期
    關(guān)鍵詞:平皿雪松松針

    曹 侃,張 爽,翁澤斌,顏翠萍,李偉東

    (1.蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院,安徽 蕪湖 241000;2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 南京 210023)

    皖南地區(qū)常見松針抑菌效果研究

    曹 侃1,張 爽1,翁澤斌2,顏翠萍2,李偉東2

    (1.蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院,安徽 蕪湖 241000;2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 南京 210023)

    為研究松針提取物抑菌效果,采用馬尾松和雪松松針的水、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇浸提物,分別對白色念珠菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗。結(jié)果表明,松針抑菌作用由強(qiáng)到弱的部位為正丁醇部位>乙酸乙酯部位>氯仿部位,總體上雪松的抑菌作用要強(qiáng)于馬尾松,松針提取物的體外抑菌作用跟松針的品種、部位以及供試菌種的種類有關(guān)。該研究可為今后松針抑菌作用的開發(fā)利用提供方向。

    松針;提取物;抑菌效果

    現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)很多植物都具有較強(qiáng)的抑菌作用,可以此作為天然防腐劑、抑菌劑來進(jìn)行開發(fā)利用。皖南地區(qū)的松針資源非常豐富,尤以馬尾松、雪松最為常見。關(guān)于松針抑菌研究的報道并不多見,而且主要集中在研究松針對腐敗菌的抑制作用上[1-2],如曾維才[3]等在研究中發(fā)現(xiàn),松針的水提和醇提物對常見食品腐敗菌有明顯的抑制作用。對于大多數(shù)的腐敗菌來說,松針?biāo)嵛锏囊志Ч却继嵛锩黠@。徐麗珊[4]等在松針提取物的抑菌作用實(shí)驗中發(fā)現(xiàn),濕地松提取液對枯草桿菌、曲霉的抑菌效果顯著。這些前期的研究都沒有針對雪松松針的研究,而且抑菌的菌種類型比較單一,采用的浸提方式也較少,不足以全面的分析出馬尾松和雪松松針的抑菌效果。因此,本實(shí)驗對以上方面進(jìn)行改進(jìn),對本地區(qū)采集的馬尾松、雪松的松針樣本進(jìn)行了抑菌實(shí)驗研究,希望能為本地區(qū)松針資源的進(jìn)一步開發(fā)利用打下基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    本實(shí)驗將皖南地區(qū)采集的馬尾松和雪松松針作為樣品,分別制備其水提、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇浸提物,以中藥銀黃顆粒、西藥林可霉素作為對照,針對標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌、標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌、臨床分離的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌,分別采用平皿法、試管法和牛津杯法進(jìn)行體外抑菌作用的篩選實(shí)驗。

    1.1 松針來源

    雪松松針采自安徽省蕪湖市蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院南校區(qū)校園內(nèi),馬尾松松針采自安徽省黃山市黃山區(qū)湯口鎮(zhèn)芳村205國道道班下三坑向陽坡處。雪松和馬尾松松針?biāo)幉木?jīng)過南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定,為松科植物雪松屬及松科植物松屬的針葉。

    1.2 儀器與試劑

    1.2.1 儀器

    FA1004電子天平(上海精科天平廠);隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);YXQ-2S-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);生物安全柜BSC-1500ⅡA2-X(濟(jì)南鑫貝亞生物技術(shù)有限公司)。

    1.2.2 試劑

    乙腈(美國TEDIA試劑公司,HPLC級);水(南京EPED制超純水);甲酸(南京化學(xué)試劑有限公司,分析純),乙酸乙酯(南京化學(xué)試劑有限公司,分析純),氯仿(南京化學(xué)試劑有限公司,分析純),正丁醇(南京化學(xué)試劑有限公司,分析純),其余試劑均為分析純。

    銀黃顆粒(江西濟(jì)民可信藥業(yè)有限公司,批號:121203);林可霉素(金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠提供,批號:121005);氯化鈉(南京小營藥業(yè)集團(tuán)有限公司,批號:12012091301);營養(yǎng)瓊脂(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號:20111228);營養(yǎng)肉湯(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號:20120420)。

    1.3 實(shí)驗菌株

    標(biāo)準(zhǔn)菌株:白色念珠菌(98001)、銅綠假單胞菌(27853),由衛(wèi)生部微生物鑒定所提供。

    臨床分離菌株:金黃色葡萄球菌、大腸桿菌,由江蘇省人民醫(yī)院微生物鑒定室提供。

    1.4 實(shí)驗方法

    1.4.1 松針浸提

    采集的雪松松針和馬尾松松針經(jīng)蕪湖市中醫(yī)院藥劑科粉粹成1 cm的小段后干燥成初樣品。取雪松和馬尾松松針各200 g,分別以10倍量和8倍量的水煎煮2次,合并提取液,于90 ℃水浴濃縮至200 mL,分別以三氯甲烷、乙酸乙酯、水飽和正丁醇各200 mL萃取3次,萃取液于90 ℃濃縮至干,以無水乙醇溶解,定容于50 mL容量瓶中,分別獲得相當(dāng)于生藥濃度4 g/mL的馬尾松和雪松松針的氯仿浸提物、乙酸乙酯浸提物、正丁醇浸提物;然后將萃取剩余藥液定容至500 mL,取100 mL加乙醇至醇濃度到50%,靜置,過濾,于90 ℃濃縮至干,以50%乙醇定容于10 mL量瓶,配置成相當(dāng)于生藥濃度4 g/mL的馬尾松和雪松的水提物;最后分別過0.45 μm微孔濾膜作為供試品溶液,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4.2 林可霉素

    在生物安全柜內(nèi)取林可霉素0.67 mL(300 mg/mL)加生理鹽水至10 mL,配成濃度為20 mg/mL的溶液。

    1.4.3 銀黃顆粒

    精密稱取銀黃顆粒10 g加蒸餾水至10 mL,配成濃度為1 g/mL的溶液,溶解后于121 ℃消毒20 min備用。

    1.4.4 抑菌實(shí)驗

    1.4.4.1 增菌培養(yǎng)

    取標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌、銅綠假單胞菌、臨床分離大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的菌株少許接種于肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)18 h,取出用生理鹽水稀釋至10-6備用。

    1.4.4.2 平皿法

    采用平皿打洞法將實(shí)驗菌株接種于營養(yǎng)肉湯中,37 ℃培養(yǎng)18 h,制成肉湯菌液,取出用滅菌后的生理鹽水稀釋至10-6備用。取肉湯瓊脂培養(yǎng)基溶化后倒入9 cm平皿約20 mL,待其凝固。用滅菌棉簽蘸取菌液均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板,然后用直徑6 mm無菌鋼圈均勻打洞,每平皿打4個洞,去除洞內(nèi)瓊脂后將供試藥液加于洞中,以滿而不溢為宜并作好標(biāo)記,每樣品做2個重復(fù),37 ℃恒溫培養(yǎng)20 h后取出,觀察結(jié)果,測定抑菌圈直徑。結(jié)果判斷:抑菌圈直徑小于10 mm為低度敏感或耐藥;10~15 mm為中度敏感;大于15 mm為高度敏感[5]。

    1.4.4.3 試管法

    采用試管兩倍稀釋法測定樣品對供試菌株的MIC。取18 h培養(yǎng)的各菌株營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物,用滅菌后的生理鹽水做10-6稀釋用于實(shí)驗。取無菌試管8支,第1~8管各加1 mL營養(yǎng)肉湯;以無菌操作吸取已稀釋好的藥物1 mL,加入第一管?;靹蚝笪? mL加入第2管中,依次倍比稀釋至第7管,混勻后自第7管棄去1 mL,此時,管中藥液濃度比依次為1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128,第8管不加藥物為對照;將肉湯培養(yǎng)18 h的供試菌液用無菌生理鹽水稀釋成10-6濃度,然后各管均加入供試菌液0.05 mL,混勻后,置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16~18 h,觀察結(jié)果。若肉湯混濁,表示細(xì)菌生長;若肉湯完全清亮,表示無細(xì)菌生長。

    將上述MIC測定中未生長細(xì)菌的各管中的肉湯接種于營養(yǎng)瓊脂平板上,37 ℃培養(yǎng)18 h后觀察有無細(xì)菌生長,以細(xì)菌不生長的最高藥物稀釋度為該藥的最低抑菌濃度(MIC)(按生藥量計算),以濁度為指標(biāo)檢查試管中有無細(xì)菌生長,以仍無細(xì)菌生長的管內(nèi)藥物的濃度為該藥的最小殺菌濃度(MBC)。重復(fù)1次。

    1.4.4.4 牛津杯法

    牛津杯和松針提取物在121 ℃條件下高壓滅菌20 min,冷卻備用。將牛津杯放置于已冷卻的含菌雙碟平板表面,吸取150 μL的松針提取物分別注入牛津杯中,于37 ℃培養(yǎng)24 h,觀察各平板抑菌圈直徑大小。每組2個平板,每個平板放置2個牛津杯,重復(fù)2次,抑菌圈直徑取平均值。

    以上抑菌實(shí)驗均為2個重復(fù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 平皿法結(jié)果

    雪松和馬尾松松針各部位體外抑菌作用平皿法篩選實(shí)驗結(jié)果如表1所示。藥物樣品5、6、7、8采用平皿法對標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌中度敏感,抑菌范圍為12.5~14.25 mm;藥物樣品6、8對臨床分離金黃色葡萄球菌中度敏感,抑菌范圍為10.5~14.5 mm;藥物樣品8對標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌、臨床分離大腸桿菌中度敏感,抑菌范圍為13~15 mm。

    表1 體外抑菌作用篩選實(shí)驗(平皿法n=2)

    2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌結(jié)果

    平皿法對標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌的抑菌實(shí)驗結(jié)果如圖1所示。

    圖1 平皿法標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌結(jié)果

    圖中(1)為馬尾松、雪松水提物結(jié)果;(2)為馬尾松、雪松氯仿部位結(jié)果;(3)為馬尾松、雪松乙酸乙酯部位結(jié)果;(4)為馬尾松、雪松正丁醇部位結(jié)果;(5)為林可霉素結(jié)果;(6)為銀黃顆粒結(jié)果。

    2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌結(jié)果

    平皿法對標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌的抑菌實(shí)驗結(jié)果如圖2所示。

    圖2 平皿法標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌結(jié)果

    圖中(1)為馬尾松、雪松水提物結(jié)果;(2)為馬尾松、雪松氯仿部位結(jié)果;(3)為馬尾松、雪松乙酸乙酯部位結(jié)果;(4)為馬尾松、雪松正丁醇部位結(jié)果;(5)為林可霉素結(jié)果;(6)為銀黃顆粒結(jié)果。

    2.1.3 大腸桿菌結(jié)果

    平皿法對大腸桿菌的抑菌實(shí)驗結(jié)果如圖3所示。

    圖3 平皿法大腸桿菌結(jié)果

    圖中(1)為馬尾松、雪松水提物結(jié)果;(2)為馬尾松、雪松氯仿部位結(jié)果;(3)為馬尾松、雪松乙酸乙酯部位結(jié)果;(4)為馬尾松、雪松正丁醇部位結(jié)果;(5)為林可霉素結(jié)果;(6)為銀黃顆粒結(jié)果。

    2.1.4 金黃色葡萄球菌結(jié)果

    平皿法對金黃色葡萄球菌的抑菌實(shí)驗結(jié)果如圖4所示。

    圖4 平皿法金黃色葡萄球菌結(jié)果

    圖中(1)為馬尾松、雪松水提物結(jié)果;(2)為馬尾松、雪松氯仿部位結(jié)果;(3)為馬尾松、雪松乙酸乙酯部位結(jié)果;(4)為馬尾松、雪松正丁醇部位結(jié)果;(5)為林可霉素結(jié)果;(6)為銀黃顆粒結(jié)果。

    2.2 試管法結(jié)果

    雪松和馬尾松松針各部位體外抑菌作用試管法篩選實(shí)驗結(jié)果如表2所示。藥物樣品1、2、5、6、7、8采用試管法對臨床分離的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有抑菌作用,抑菌MIC為0.125~1.25 g/mL;藥物樣品1、2、5、6、7、8對標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌、銅綠假單胞菌有抑菌作用,抑菌MIC為0.125~1 g/mL;藥物樣品3對標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌有抑菌作用,抑菌MIC為1 g/mL。

    表2 體外抑菌作用篩選實(shí)驗(試管法n=2)

    2.3 牛津杯法結(jié)果

    雪松和馬尾松松針各部位體外抑菌作用牛津杯法篩選實(shí)驗結(jié)果如表3所示。藥物樣品1、2、3、4、5、6、7、8采用牛津杯法對標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌、銅綠假單胞菌、臨床分離金黃色葡萄球菌、大腸桿菌不敏感。

    表3 體外抑菌作用篩選實(shí)驗(牛津杯法n=2)

    3 討論

    本研究發(fā)現(xiàn),馬尾松和雪松松針的不同提取物對標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有一定程度的抑菌作用;然而不同品種的松針、同一種松針的不同提取物,對不同供試菌的抑菌作用有明顯差異。

    實(shí)驗結(jié)果顯示,雪松松針對供試菌的抑菌作用強(qiáng)于馬尾松,不同提取物的抑菌作用為正丁醇>乙酸乙酯>氯仿,因此未來在研發(fā)松針抑菌劑時可以考慮以雪松的正丁醇浸提物作為重點(diǎn);同時在本實(shí)驗研究的供試菌中,松針提取物對標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌的抑菌效果更為明顯,因此可以重點(diǎn)開發(fā)松針對含有標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌物質(zhì)的保護(hù)。

    [1] 肖靖萍,任宇紅.松針抑菌作用的研究[J].食品科學(xué),1994(2):52-54.

    [2] 張軍民,石曉峰,范彬.雪松的化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].中成藥,2009,31(6):928-933.

    [3] 曾維才,賈利蓉.松針提取物抑菌作用的研究[J].食品科學(xué),2009,30(7):87-90.

    [4] 徐麗珊,張萍華,張敏歡.松針提取物的抑菌作用初探[J].食品科學(xué),2009,30(1):38-41.

    [5] 李榆梅.微生物學(xué)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2002:131-132.

    2014-06-26

    安徽省青年人才基金項目:裕溪口香菜中腐敗菌菌相分析及保鮮技術(shù)研究(2010SQRW188);安徽省省級專業(yè)綜合改革試點(diǎn):食品營養(yǎng)與檢測專業(yè)(2013zy101);蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院自然科學(xué)研究項目:皖南地區(qū)松針抗氧化有效部位的篩選及特征圖譜的研究(Wzyzr201315)

    曹侃(1984-),女,安徽蕪湖人,蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院講師,碩士。研究方向:生物技術(shù); 通訊作者:李偉東(1969-),男,江蘇南京人,南京中醫(yī)藥大學(xué)副研究員,博士。研究方向:中藥學(xué)。

    R963

    A

    1008-4657(2014)04-0020-07

    寸曉非]

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