無患子藥材及總皂苷HPLC指紋圖譜

(西華大學生物工程學院，四川 成都 610039 )

無患子屬于無患子科無患子屬，主產(chǎn)于東南亞各國，我國的長江流域、南部各省及海南島等地區(qū)[1]。無患子的主要化學成分為無患子皂苷(sapindus saponin)、脂肪油、蛋白質(zhì)等[2]。無患子皂苷主要是三萜類皂苷和倍半萜類糖苷，常春藤皂苷元是無患子皂苷元的最主要皂苷元。無患子有很多種生物活性，在抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗真菌、抗炎、殺精、保肝等方面均有作用[2-5]。無患子果皮提取物的表面活性較強，有較強的殺菌作用[6]，同時無患子還是一種新型的去皮膚金屬沾染洗滌劑[7]。這種洗滌劑對皮膚刺激小，對機體基本無害，對各種重金屬對皮膚沾染洗脫率在90%以上[2，8]。本文采用高效液相色譜梯度洗脫法，對無患子藥材、無患子總皂苷進行了指紋圖譜的研究，可為無患子藥材、無患子總皂苷的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2487雙波長紫外檢測器(美國Waters公司)；JJ1004小型超聲波清洗器(東莞市嘉勁機械有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.2試劑

無患子藥材產(chǎn)地如表1所示；無患子總皂苷10批(根據(jù)大孔吸附樹脂的分離純化工藝制得)；常春藤皂苷元(批號111733-201205)對照品(中國生物制品檢定所提供)；乙腈為色譜純(JT-baker)。

表1 無患子藥材產(chǎn)地

2 試驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Cromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，乙腈-水二元梯度洗脫，檢測波長為210 nm，流速1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為20 μL；記錄時間為70 min。梯度洗脫程序如表2所示。

表2 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取常春藤皂苷元對照品適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.503 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 無患子藥材溶液制備

取干燥潔凈的無患子果皮粉碎，過80目篩，精密稱取藥材粉末2.008 g，加甲醇50 mL，超聲提取30 min[9]，過濾，用適量的甲醇洗滌殘渣和容器，合并濾液與洗液，減壓回收溶劑至10 mL，加鹽酸2 mL，加熱回流水解5 h，放冷，放冷后用三氯甲烷萃取3次，每次用量20 mL，合并三氯甲烷層，減壓回收溶劑至干，殘渣用甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得[10]。

2.2.3 無患子總皂苷溶液制備

精密稱取無患子總皂苷適量，加甲醇10 mL，鹽酸2 mL，加熱回流水解5 h，放冷后用三氯甲烷萃取3次，每次用量20 mL，合并三氯甲烷層，減壓回收溶劑至干，殘渣用甲醇溶解，并定容至10 mL容量瓶中，搖勻，即得[10]。

2.3 方法學考察

2.3.1 穩(wěn)定性試驗

按2.2項下供試品溶液制備方法制得供試液，分別于0、4、8、16、24 h精密吸取供試品溶液20 μL注入高效液相色譜儀，于210 nm下測定，測得常春藤皂苷元峰面積值并計算RSD值。結果表明，常春藤皂苷元峰面積的RSD值分別為1.06%和0.62%，供試品溶液(無患子藥材溶液和無患子總皂苷)均在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.2 重復性試驗

取同一批樣品5份，按2.2項下供試品溶液制備方法制得5份供試品溶液，吸取供試品溶液20 μL注入高效液相色譜儀，于210 nm下測定，測得常春藤皂苷元峰面積值并計算RSD值。結果表明，常春藤皂苷元峰面積的RSD值分別為1.18%和1.47%，均小于2%，說明2種樣品重現(xiàn)性好，該方法穩(wěn)定可靠。

2.4 指紋圖譜的測定

分別精密吸取上述2種供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄70 min。溶劑空白如圖1所示。

圖1 溶劑空白

如圖1所示，除了在2 min處出現(xiàn)溶劑峰和40～44 min之間有3個由于梯度變化造成的峰外，流動相中沒有其他峰干擾樣品的分析檢測。常春藤皂苷元對照品如圖2所示。

圖2 常春藤皂苷元對照品

2.5 無患子藥材指紋圖譜及相似度分析結果

將采集的10批無患子藥材按照供試品溶液制備方法，制成S01—10號供試品溶液，按照擬定的色譜條件進行測定，采集各批無患子藥材的HPLC圖譜。將HPLC圖譜處理后導入由國家藥典委員會頒布的“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004版A”軟件進行相似度分析，圖中峰頂端有點標記的為共有峰。指紋圖譜匹配圖見圖3，相似度分析結果見表3。

圖3 10批無患子藥材HPLC指紋圖譜匹配圖

由圖3及表3可知，10批無患子藥材的色譜峰之間無明顯差異，除了第3批藥材外，其他9批藥材相似度均在0.9以上，說明不同產(chǎn)地之間的無患子藥材無明顯差異，穩(wěn)定性好，建立的指紋圖譜方法可行。

2.6 無患子總皂苷指紋圖譜及相似度分析結果

將按工藝制得的無患子總皂苷按照無患子總皂苷供試品溶液制備方法，制成供試品溶液，按照擬定的色譜條件進行測定，采集各批無患子總皂苷的HPLC圖譜。將HPLC圖譜處理后導入由國家藥典委員會頒布的“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004版A”軟件進行相似度分析。指紋圖譜匹配圖見圖4，相似度分析結果見表4。

圖4 10批無患子總皂苷HPLC指紋圖譜匹配圖

項目S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10對照指紋圖譜S110.9840.9900.8370.8370.8360.9990.9980.9840.9990.982S20.98410.9980.8390.8400.8400.9880.9900.9990.9880.982S30.9900.99810.8420.8420.8420.9930.9950.9980.9930.985S40.8370.8390.84210.9990.9990.8380.8400.8390.8380.920S50.8370.8400.8420.99910.9990.8380.8400.8400.8380.920S60.8360.8400.8420.9990.99910.8380.8400.8400.8380.920S70.9990.9880.9930.8380.8380.83810.9990.9880.9990.984S80.9980.9900.9950.8400.8400.8400.99910.9900.9990.985S90.9840.9990.9980.8390.8400.8400.9880.99010.9880.982S100.9990.9880.9930.8380.8380.8380.9990.9990.98810.984對照指紋圖譜0.9820.9820.9850.9200.9200.9200.9840.9850.9820.9841

由圖4及表4可知，10批無患子總皂苷之間無明顯差異，相似度均在0.9以上，說明無患子純化工藝穩(wěn)定可靠。

3 結論

本研究是以皂苷元類成分作為高效液相色譜指紋圖譜主要分析成分，由于只有常春藤皂苷元標準品，且無患子皂苷中主要的皂苷元也是常春藤皂苷元，故對于其他的皂苷元成分沒有作深入研究。

在不同產(chǎn)地采集的無患子藥材，主要成分含量差異不是很大，除了第3批(浙江)相似度未達到0.9外，其余9批相似度均達到0.9以上。經(jīng)大孔吸附樹脂分離純化工藝得到的10批無患子總皂苷相似度較高，均達到0.9以上，說明大孔吸附樹脂分離純化工藝穩(wěn)定可靠。

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