3′—大豆苷元磺酸鈉對四氯化碳所致小鼠肝損傷和肝藥酶的影響

曾艷紅　魏桂林　謝嬌　梁冬梅　李斌　黃志華　曾靖

[摘要] 目的 研究3′-大豆苷元磺酸鈉（3′-DSS）對四氯化碳（CCl4）所致小鼠肝損傷的影響。 方法 取雄性昆明種小鼠60只，每組12只，隨機(jī)分為對照組、模型組、聯(lián)苯雙酯陽性對照組、0.1 mg/kg 3′-DSS組和0.3 mg/kg 3′-DSS組。每星期進(jìn)行2次腹腔注射10%CCl4植物油溶液0.1 ml/10 g，造成慢性肝損傷模型，期間給予灌服2.5 mg/kg聯(lián)苯雙酯、0.1 mg/kg 3′-DSS、0.3 mg/kg 3′-DSS，持續(xù)6周，給藥結(jié)束后，分別取血和肝臟，分離血清，制備肝均漿，檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的活性和肝藥酶含量。 結(jié)果 與對照組比較，模型組小鼠肝功能明顯下降，ALT、AST水平明顯升高，肝藥酶含量明顯下降；與模型組比較，0.1、0.3 mg/kg 3′-DSS治療組ALT、AST水平均有明顯下降；肝藥酶含量也明顯增加。 結(jié)論 3′-DSS對CCl4所致小鼠肝損傷具有明顯的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 3′-大豆苷元磺酸鈉；肝損傷；四氯化碳；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；肝藥酶

[中圖分類號(hào)] R-05 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）07（c）-0018-03

肝臟是人體最大的實(shí)質(zhì)性器官，擔(dān)負(fù)著消化、解毒、分泌和生物合成功能，其功能障礙直接影響人體健康，甚至危及生命。肝病的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及炎癥反應(yīng)、免疫功能紊亂、代謝障礙、自由基損害及質(zhì)膜損傷等多個(gè)生理病理過程。對肝損傷的防治目前仍是全球醫(yī)療范圍內(nèi)極其重要的一個(gè)課題。因此，本研究通過建立實(shí)驗(yàn)性肝損傷動(dòng)物模型、研究肝病的發(fā)病機(jī)制，篩選保肝藥物，探索其作用機(jī)制，對于揭示肝損傷的生理病理變化和提高臨床治療水平具有十分重要的意義。

3′-大豆苷元磺酸鈉（3′-daidzein sulfonate sodium，3′-DSS）是中藥葛根的主要有效成分大豆苷元結(jié)構(gòu)修飾和改性的新合成的水溶性物質(zhì)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。目前，國內(nèi)外對3′-DSS對肝損傷的保護(hù)作用研究尚未見報(bào)道。有研究結(jié)果顯示，3′-DSS具有耐缺氧、抗氧化、抗心律失常及心肌缺血再灌注損傷再灌注損傷有保護(hù)等作用[1-7]。本研究擬通過檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的活性和肝藥酶含量，觀察3′-DSS處理后對四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的保護(hù)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性昆明（Kunming）小鼠，體重（21±3） g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2011-003，合格證號(hào)：NO.4304701590。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

CCl4（分析純，江西洪都試劑化工廠生產(chǎn)），臨用前與精制植物油混合配成10%（W/W）CCl4植物油溶液；3′-大豆苷元由沈陽藥科大學(xué)植化教研室提供，用生理鹽水配成所需濃度；聯(lián)苯雙酯滴丸購自北京協(xié)和藥廠，配成混懸液。

1.3 儀器

BS224S電子天平（德國賽多利斯集團(tuán)）；MIKRO22R低速冷凍離心機(jī)（杭州普瑞特儀器有限公司）；HS-B6恒溫水浴箱（湖北省黃石市醫(yī)療器械廠）；微量加樣器（GILSON公司、Dragon Lab、Eppendorf公司）；全自動(dòng)生化分析儀檢測（德國拜耳1605型），722N可見光分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

按體重將小鼠隨機(jī)分為5組，每組12只，分別為正常對照組、模型組、陽性藥物對照組（2.5 mg/kg聯(lián)苯雙酯）以及0.1、0.3 mg/kg 3′-DSS組，正常組和模型組給予生理鹽水（0.1 ml/10 g），每天按體重灌胃給藥，給藥劑量為0.1 ml/10 g，此外每周二、六除對照組外均進(jìn)行腹腔注射10%CCl4植物油溶液0.1 ml/10 g，并記錄小鼠體重以及活動(dòng)情況，持續(xù)6周。另一組分組與給藥同上，連續(xù)給藥10 d。末次給藥后禁食過夜，24 h后斷頭處死，放盡血液并迅速剖開腹腔，用冷凍生理鹽水冷卻沖洗肝臟并取出，稱取一定量的肝組織，剪碎，加4倍量冰冷的15%甘油-20 mmoL磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4），用玻璃勻漿器勻漿，4℃下用高速冷凍離心機(jī)以9000×g離心15 min，得上清液。采用雙縮脲法測定上清液蛋白質(zhì)含量[8]。在比色杯中加入15%甘油-20 mmoL PBS 2 ml和上清液部分0.1 ml，混勻后加入數(shù)毫克保險(xiǎn)粉并掃描400～500 nm的基線（調(diào)零）。然后在比色杯中通入一氧化碳約1 min，靜置3 min，再于400～500 nm處掃描樣品得到肝藥酶的吸收光譜曲線，記錄420、450、490 nm處的吸收度，按方法計(jì)算肝藥酶含量[9]。

1.5 標(biāo)本采集

給藥結(jié)束后24 h，取血，室溫靜置30 min后，12 000×g離心10 min，取血清，-80℃保存，用以檢測ALT、AST[10]；另一組取肝臟用以檢測肝藥酶含量。

1.6 檢測方法

采用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清中ALT、AST檢測；采用分光光度計(jì)測定小鼠肝藥酶含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

在連續(xù)灌胃給藥期間，小鼠的皮毛光澤，活動(dòng)良好，反應(yīng)敏捷，體重均有所增加。腹腔注射CCl4的植物油溶液后，除空白對照組外小鼠明顯活動(dòng)性減弱，皮毛暗淡，模型組的小鼠出現(xiàn)行動(dòng)緩慢現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，正常組小鼠活動(dòng)正常，皮毛色澤、活動(dòng)情況均良好，模型組小鼠較為萎靡，活動(dòng)情況顯著減弱，陽性藥物組、3′-DSS組的皮毛略顯粗糙，活動(dòng)情況一般。

2.2 3′-DSS對CCl4處理小鼠血清ALT、AST的影響

結(jié)果顯示：腹腔注射CCl4可引起小鼠慢性肝損傷，模型組血清ALT、AST活性明顯高于空白對照組（P<0.01），表示造模成功。3′-DSS各劑量組可顯著抑制由CCl4造成的血清ALT、AST活性升高（P<0.05；P<0.01），結(jié)果提示3′-DSS對由CCl4引起的小鼠慢性肝損傷具有一定的保護(hù)作用（表1）。

2.3 3′-DSS對小鼠肝藥酶含量的影響

模型組小鼠與對照組比較肝藥酶含量顯著下降，與模型組比較3′-DSS組肝藥酶含量顯著增加，表明3′-DSS具有誘導(dǎo)藥酶的作用（表2）。

3 討論

近年許多文獻(xiàn)指出，肝組織細(xì)胞的損傷與自由基毒性反應(yīng)關(guān)系非常密切，CCl4致肝損傷動(dòng)物模型是研究護(hù)肝藥最常用的模型。CCl4損傷肝細(xì)胞的作用機(jī)制主要是CCl4在肝微粒體細(xì)胞色素P450代謝生成氧自由基，這些自由基具有很強(qiáng)的生物毒性，攻擊肝細(xì)胞膜上的磷脂分子，使細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，繼而與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)大分子發(fā)生共價(jià)結(jié)合。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞，膜的通透性增加，使胞質(zhì)內(nèi)酶類滲入到血液中，同時(shí)細(xì)胞外水分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使肝細(xì)胞發(fā)生氣球樣變等，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞壞死，使更多的酶類釋放進(jìn)入血液，肝組織中酶含量下降。由于整個(gè)肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶活力比血清內(nèi)該酶活力高100倍，只要有1%肝細(xì)胞膜受損便可使血清酶活力升高1倍。因此，血清轉(zhuǎn)氨酶升高，在一定程度上反映了肝細(xì)胞損害和壞死的程度[11-12]。在輕、中度肝損傷時(shí)，以ALT升高最為明顯，ALT升高遠(yuǎn)大于AST升高；當(dāng)嚴(yán)重肝細(xì)胞損傷時(shí)，線粒體受損，可導(dǎo)致線粒體內(nèi)的酶被釋放入血，此時(shí)AST升高更為明顯，血清中AST/ALT比值升高。在實(shí)驗(yàn)中，CCl4模型肝損傷AST比ALT升高更為顯著，肝損傷較為嚴(yán)重[13-15]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，3′-DSS低、高劑量組的血清ALT、AST活性明顯低于模型組，提示3′-DSS可減輕CCl4所致的肝損傷，其中低劑量組較高劑量組的作用更為顯著。

肝藥酶即肝細(xì)胞微粒體中細(xì)胞色素P450系統(tǒng)，是肝臟代謝藥物的關(guān)鍵酶[16]，CCl4作為一種肝毒劑可致肝微粒體細(xì)胞色素P450含量降低。研究還表明，3′-DSS能明顯減輕這種降低作用，提示3′-DSS能在一定程度上誘導(dǎo)肝微粒體細(xì)胞色素P450的產(chǎn)生或者可以對抗肝毒劑對肝微粒體細(xì)胞色素P450產(chǎn)生損傷的某些環(huán)節(jié)，從而提高肝臟的代謝能力，促進(jìn)肝藥酶對毒物的清除，起到保護(hù)肝臟的作用。

綜上所述，3′-DSS對CCl4致小鼠肝損傷有明顯的保護(hù)作用，能明顯降低ALT、AST的水平，明顯增加肝藥酶含量，其具體的肝保護(hù)作用機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 曾靖，黃志華，邱峰，等.3′-大豆苷元磺酸鈉抗心律失常作用研究[J].中藥藥理與臨床，2006，22（1）：37-39.

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[12] 冀潤利，趙青娥.水飛薊素對四氯化碳致小鼠肝損傷的保護(hù)作用[J].中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2012，28（3）：279-280.

[13] 龐輝，玉艷紅，湯桂芳，等.三叉苦提取物對小鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷的保護(hù)作用[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，23（6）：961-962.

[14] 劉穎姝，劉芳萍，李昌文，等.龍葵對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J].中國獸藥雜志，2012，46（9）：15-17.

[15] 李樹卿，王玉卓.灰樹花多糖對四氯化碳致急性肝損傷的保護(hù)作用[J].中國老年學(xué)雜志，2010，30（18）：2640-2642.

[16] 張均田.現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)·中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1998：1643.

（收稿日期：2014-04-21 本文編輯：林利利）

2.2 3′-DSS對CCl4處理小鼠血清ALT、AST的影響

結(jié)果顯示：腹腔注射CCl4可引起小鼠慢性肝損傷，模型組血清ALT、AST活性明顯高于空白對照組（P<0.01），表示造模成功。3′-DSS各劑量組可顯著抑制由CCl4造成的血清ALT、AST活性升高（P<0.05；P<0.01），結(jié)果提示3′-DSS對由CCl4引起的小鼠慢性肝損傷具有一定的保護(hù)作用（表1）。

2.3 3′-DSS對小鼠肝藥酶含量的影響

模型組小鼠與對照組比較肝藥酶含量顯著下降，與模型組比較3′-DSS組肝藥酶含量顯著增加，表明3′-DSS具有誘導(dǎo)藥酶的作用（表2）。

3 討論

近年許多文獻(xiàn)指出，肝組織細(xì)胞的損傷與自由基毒性反應(yīng)關(guān)系非常密切，CCl4致肝損傷動(dòng)物模型是研究護(hù)肝藥最常用的模型。CCl4損傷肝細(xì)胞的作用機(jī)制主要是CCl4在肝微粒體細(xì)胞色素P450代謝生成氧自由基，這些自由基具有很強(qiáng)的生物毒性，攻擊肝細(xì)胞膜上的磷脂分子，使細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，繼而與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)大分子發(fā)生共價(jià)結(jié)合。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞，膜的通透性增加，使胞質(zhì)內(nèi)酶類滲入到血液中，同時(shí)細(xì)胞外水分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使肝細(xì)胞發(fā)生氣球樣變等，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞壞死，使更多的酶類釋放進(jìn)入血液，肝組織中酶含量下降。由于整個(gè)肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶活力比血清內(nèi)該酶活力高100倍，只要有1%肝細(xì)胞膜受損便可使血清酶活力升高1倍。因此，血清轉(zhuǎn)氨酶升高，在一定程度上反映了肝細(xì)胞損害和壞死的程度[11-12]。在輕、中度肝損傷時(shí)，以ALT升高最為明顯，ALT升高遠(yuǎn)大于AST升高；當(dāng)嚴(yán)重肝細(xì)胞損傷時(shí)，線粒體受損，可導(dǎo)致線粒體內(nèi)的酶被釋放入血，此時(shí)AST升高更為明顯，血清中AST/ALT比值升高。在實(shí)驗(yàn)中，CCl4模型肝損傷AST比ALT升高更為顯著，肝損傷較為嚴(yán)重[13-15]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，3′-DSS低、高劑量組的血清ALT、AST活性明顯低于模型組，提示3′-DSS可減輕CCl4所致的肝損傷，其中低劑量組較高劑量組的作用更為顯著。

肝藥酶即肝細(xì)胞微粒體中細(xì)胞色素P450系統(tǒng)，是肝臟代謝藥物的關(guān)鍵酶[16]，CCl4作為一種肝毒劑可致肝微粒體細(xì)胞色素P450含量降低。研究還表明，3′-DSS能明顯減輕這種降低作用，提示3′-DSS能在一定程度上誘導(dǎo)肝微粒體細(xì)胞色素P450的產(chǎn)生或者可以對抗肝毒劑對肝微粒體細(xì)胞色素P450產(chǎn)生損傷的某些環(huán)節(jié)，從而提高肝臟的代謝能力，促進(jìn)肝藥酶對毒物的清除，起到保護(hù)肝臟的作用。

綜上所述，3′-DSS對CCl4致小鼠肝損傷有明顯的保護(hù)作用，能明顯降低ALT、AST的水平，明顯增加肝藥酶含量，其具體的肝保護(hù)作用機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

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[6] 曾靖，李良東，黃志華，等.3′-大豆苷元磺酸鈉對豚鼠離體右心房自律性及收縮特性的影響[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥雜志，2007，18（7）：1553-1554.

[7] 李良東，黃志華，曾靖，等.DSS對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)與抗氧化作用的關(guān)系[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病，2010，22（5）：10-12.

[8] 徐叔云，卞如濂，陳修，等.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：511.

[9] Omura T，Sato R.The carbon monoxide bingding pigment of liver microsomes[J].J Biol Chem，1964，239（7）：2370-2385.

[10] 田豐林，尹明浩.補(bǔ)肺元湯對四氯化碳引起小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J].延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào)，2009，32（2）：94-96.

[11] 宋小莉.葛根對化學(xué)性肝損傷小鼠的保護(hù)作用[J].山東中醫(yī)雜志，2010，29（2）：121-122.

[12] 冀潤利，趙青娥.水飛薊素對四氯化碳致小鼠肝損傷的保護(hù)作用[J].中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2012，28（3）：279-280.

[13] 龐輝，玉艷紅，湯桂芳，等.三叉苦提取物對小鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷的保護(hù)作用[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，23（6）：961-962.

[14] 劉穎姝，劉芳萍，李昌文，等.龍葵對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J].中國獸藥雜志，2012，46（9）：15-17.

[15] 李樹卿，王玉卓.灰樹花多糖對四氯化碳致急性肝損傷的保護(hù)作用[J].中國老年學(xué)雜志，2010，30（18）：2640-2642.

[16] 張均田.現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)·中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1998：1643.

（收稿日期：2014-04-21 本文編輯：林利利）

2.2 3′-DSS對CCl4處理小鼠血清ALT、AST的影響

結(jié)果顯示：腹腔注射CCl4可引起小鼠慢性肝損傷，模型組血清ALT、AST活性明顯高于空白對照組（P<0.01），表示造模成功。3′-DSS各劑量組可顯著抑制由CCl4造成的血清ALT、AST活性升高（P<0.05；P<0.01），結(jié)果提示3′-DSS對由CCl4引起的小鼠慢性肝損傷具有一定的保護(hù)作用（表1）。

2.3 3′-DSS對小鼠肝藥酶含量的影響

模型組小鼠與對照組比較肝藥酶含量顯著下降，與模型組比較3′-DSS組肝藥酶含量顯著增加，表明3′-DSS具有誘導(dǎo)藥酶的作用（表2）。

3 討論

近年許多文獻(xiàn)指出，肝組織細(xì)胞的損傷與自由基毒性反應(yīng)關(guān)系非常密切，CCl4致肝損傷動(dòng)物模型是研究護(hù)肝藥最常用的模型。CCl4損傷肝細(xì)胞的作用機(jī)制主要是CCl4在肝微粒體細(xì)胞色素P450代謝生成氧自由基，這些自由基具有很強(qiáng)的生物毒性，攻擊肝細(xì)胞膜上的磷脂分子，使細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，繼而與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)大分子發(fā)生共價(jià)結(jié)合。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞，膜的通透性增加，使胞質(zhì)內(nèi)酶類滲入到血液中，同時(shí)細(xì)胞外水分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使肝細(xì)胞發(fā)生氣球樣變等，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞壞死，使更多的酶類釋放進(jìn)入血液，肝組織中酶含量下降。由于整個(gè)肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶活力比血清內(nèi)該酶活力高100倍，只要有1%肝細(xì)胞膜受損便可使血清酶活力升高1倍。因此，血清轉(zhuǎn)氨酶升高，在一定程度上反映了肝細(xì)胞損害和壞死的程度[11-12]。在輕、中度肝損傷時(shí)，以ALT升高最為明顯，ALT升高遠(yuǎn)大于AST升高；當(dāng)嚴(yán)重肝細(xì)胞損傷時(shí)，線粒體受損，可導(dǎo)致線粒體內(nèi)的酶被釋放入血，此時(shí)AST升高更為明顯，血清中AST/ALT比值升高。在實(shí)驗(yàn)中，CCl4模型肝損傷AST比ALT升高更為顯著，肝損傷較為嚴(yán)重[13-15]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，3′-DSS低、高劑量組的血清ALT、AST活性明顯低于模型組，提示3′-DSS可減輕CCl4所致的肝損傷，其中低劑量組較高劑量組的作用更為顯著。

肝藥酶即肝細(xì)胞微粒體中細(xì)胞色素P450系統(tǒng)，是肝臟代謝藥物的關(guān)鍵酶[16]，CCl4作為一種肝毒劑可致肝微粒體細(xì)胞色素P450含量降低。研究還表明，3′-DSS能明顯減輕這種降低作用，提示3′-DSS能在一定程度上誘導(dǎo)肝微粒體細(xì)胞色素P450的產(chǎn)生或者可以對抗肝毒劑對肝微粒體細(xì)胞色素P450產(chǎn)生損傷的某些環(huán)節(jié)，從而提高肝臟的代謝能力，促進(jìn)肝藥酶對毒物的清除，起到保護(hù)肝臟的作用。

綜上所述，3′-DSS對CCl4致小鼠肝損傷有明顯的保護(hù)作用，能明顯降低ALT、AST的水平，明顯增加肝藥酶含量，其具體的肝保護(hù)作用機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2014-04-21 本文編輯：林利利）