基質(zhì)分散固相萃取高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定減肥保健食品中20種違禁添加藥物

馬微等

摘要建立了測定減肥保健食品中20種違禁添加藥物（芬氟拉明、苯丙醇胺、西布曲明、舍曲林、利莫那班、安非他酮、西酞普蘭、氟西汀、苯氟雷司、托吡酯、唑尼沙胺、咖啡因、酚酞、大黃素、吲達(dá)帕胺、布美他尼、托拉塞米、三氨喋啶、奧利司他、苯乙雙胍）的基質(zhì)分散固相萃取高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。不同類型的樣品經(jīng)乙醇丙酮（7∶3， V/V）超聲提取后，提取液經(jīng)

1引言

近年來，在減肥類保健食品中非法添加化學(xué)藥物的事件時(shí)有發(fā)生，雖然《中華人民共和國食品安全法》第十條明確規(guī)定，食品中不得加入藥物，仍有不法廠商非法摻入減肥藥物?，F(xiàn)今，減肥藥物的種類很多，除了傳統(tǒng)治療藥物食欲抑制劑＼[1＼]外，近些年又增加了許多輔助性治療藥物（瀉藥、消化吸收阻滯劑，利尿劑、雙胍類降糖藥和中樞興奮劑等）＼[2＼]。由于這些藥物有嚴(yán)重副作用，已被多數(shù)國家撤銷或禁止，同時(shí)消費(fèi)者又是在不知情未按使用方法的情況下長期食用添加違禁藥物的保健食品，嚴(yán)重危害食用者健康。

目前，對(duì)這些減肥藥物的的檢測多集中在體液＼[3，4＼]、藥物制劑＼[5～7＼]中，主要應(yīng)用于法醫(yī)、毒理、臨床及制藥等領(lǐng)域，在食品樣品中的測定報(bào)道較少，涉及的方法有光譜法＼[5，7＼]、薄層色譜法＼[8＼]、電化學(xué)法＼[9＼]、高效液相色譜法（HPLC）＼[6，10＼]、氣相色譜法（GC）＼[11＼]、高效液相色譜質(zhì)譜法（HPLC/MS）＼[12，13＼]、氣相色譜質(zhì)譜法（GC/MS ）＼[14＼] 、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC/MS/MS）＼[3，4，15～18＼]等。其中光譜法、電化學(xué)法、薄層色譜法、GC和HPLC法的方法靈敏度較低，容易受到復(fù)雜基質(zhì)干擾，選擇性和特異性較差； GC/MS法需要衍生化，步驟相對(duì)復(fù)雜。報(bào)道的LC/MS/MS法分析藥物的種類不多，沒有對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化，且對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)保健食品的分析缺少針對(duì)性。本研究采用基質(zhì)分散固相萃取高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（QQQ）聯(lián)用技術(shù)，建立了減肥保健食品中違禁添加20種減肥藥物的測定方法，并結(jié)合飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF）技術(shù)對(duì)藥物進(jìn)行精確分子質(zhì)量的測定，在碰撞誘導(dǎo)解離（CID）模式下，得到化合物及其碎片離子的分子式和精確分子量，可進(jìn)一步對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)和裂解規(guī)律加以確證，使得定性分析準(zhǔn)確性更高，為減肥保健食品中違禁添加減肥藥物的高通量，高準(zhǔn)確度檢測提供了可靠的分析平臺(tái)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

ACQUITY超高效液相色譜議、Quattro micro API三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀、MAILDI SYNAPT HDMS 四極桿飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜儀，配備ESI離子源， MassLynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國Waters公司）； KQ600B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； MS2型漩渦振蕩器（德國IKA公司）； MilliQ超純水器（美國 Millipore公司）； N21000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本Eyela公司），配有BC255型真空冷卻系統(tǒng)（日本Yamato公司）； CR21G型高速冷凍離心機(jī)（日本Hitachi公司）； Acrodisc GHP雙性濾膜（美國Pall公司），PSA和ODS散裝吸附劑。

芬氟拉明、苯丙醇胺、西布曲明、舍曲林、吲達(dá)帕胺、布美他尼、大黃素、酚酞（純度≥97%， 中國藥品生物制品檢定所）； 利莫那班（純度≥99%，日本Toronto Research Chemicals Inc公司）； 托拉塞米、三氨喋啶（純度≥98%，日本Tokyo Kasei Kodyo公司）； 安非他酮、西酞普蘭、氟西汀、苯氟雷司、托吡酯、唑尼沙胺、奧利司他、苯乙雙胍（純度均≥99%，美國Sigma公司）； 咖啡因（純度≥97%，德國Dr Ehrenstorfer公司）； 甲醇（HPLC級(jí)，美國Fisher公司）； 其它試劑均為分析純（北京化工廠）。氮?dú)?、氬氣?gt;99.999%）； 實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)MilliQ凈化系統(tǒng)（0. 22 μm過濾膜）過濾的去離子水。0.4 V； 二級(jí)錐孔電壓： 4.0 V； 離子源溫度100 ℃； 去溶劑氣溫度200 ℃； 去溶劑氣流量350 L/h； 錐孔氣流量40 L/h； 光電倍增器電壓650 V； 碰撞氣體為氬氣，碰撞氣壓2.6 ×104 Pa，數(shù)據(jù)采集模式：棒狀（Centroid）； 掃描采集時(shí)間：0.5 s； Tof 運(yùn)行模式：V模式。

2.2.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取各藥物10.0 mg，分別用甲醇和少量水溶解并稀釋，制成1.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，

Symbolm@@ 18 ℃保存?zhèn)溆?。臨用時(shí)，用甲醇稀釋上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。各取單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，以初始流動(dòng)相為稀釋液配制所需濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.4兩步離心樣品制備過程將樣品粉碎后，準(zhǔn)確稱取試樣粉末1.0 g置于50 mL具塞錐形瓶中，加入7 mL乙醇和3 mL丙酮，渦旋混勻，超聲提取15 min后，加入3 g無水MgSO4、1 g NaCl、1 g乙酸鈉，手搖1 min，以10000 r/min離心5 min，待凈化。取上清液于15 mL螺旋蓋聚丙烯離心管中，加入300 mg無水MgSO4、300 mg PSA和250 mg ODS，在旋渦混合器上混合2 min，10000 r/min 離心5 min。準(zhǔn)確移取 5 mL凈化液于15 mL玻璃具塞離心管中，經(jīng)40℃氮吹儀吹干后，用初始流動(dòng)相溶解并定容至1.0 mL， 過0.22 μm濾膜后，供液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測定。

3結(jié)果與討論

3.1流動(dòng)相的選擇

由于電噴霧質(zhì)譜的電離是在溶液狀態(tài)，因此流動(dòng)相的組成和添加劑除了影響分析物的保留時(shí)間和峰形外，還會(huì)影響到分析物的離子化效率，從而影響到目標(biāo)化合物的檢測靈敏度。本實(shí)驗(yàn)比較研究了在甲醇水流動(dòng)相體系中分別加入0.1%甲酸、5 mmol/L乙酸銨、10 mmol/L乙酸銨等添加劑的影響。結(jié)果表明，以甲醇10 mmol/L乙酸銨溶液作為流動(dòng)相獲得了最優(yōu)的色譜分離效果和質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)。這是由于這20種減肥藥多是苯胺型化合物，帶有仲胺基或叔胺基，當(dāng)流動(dòng)相中加入適量酸性物質(zhì)時(shí)，會(huì)促進(jìn)胺電離，并為陽離子的形成提供了必需的質(zhì)子來源，從而提高其離子化效率。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，在流動(dòng)相種未填加乙酸銨時(shí)，苯乙雙胍、氟西汀、舍曲林、西布曲明的峰形脫尾，這可能是由于固定相硅膠基質(zhì)上的硅醇基與這些藥物分子由于氫鍵等強(qiáng)的分子間相互作用力而強(qiáng)烈保留，造成峰形脫尾，通過在流動(dòng)相中加入乙酸銨，有助于色譜柱內(nèi)硅膠上硅醇基的質(zhì)子化，消除了硅醇基與胺之間的相互作用，減少了色譜峰的拖尾，改善了20種減肥藥物的色譜峰形和分離效果。

3.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化及定性信息的確定

3.2.1四極桿飛行時(shí)間（QTof）質(zhì)譜確定裂解途徑通過對(duì)單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，確定各目標(biāo)分析物的準(zhǔn)分子離子峰（母離子），采用MassLynx軟件中Elemental Composition功能的分析得到各目標(biāo)分析物的元素組成和質(zhì)量精確度（絕對(duì)值均小于5×106），所測得的質(zhì)量數(shù)為該目標(biāo)分析物＼[M+H＼]+或＼[M-H＼]

Symbolm@@ 精確分子量，再通過氬氣碰撞母離子產(chǎn)生的碎片離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得到子離子的精確分子量。根據(jù)每一種藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，所測得的一個(gè)母離子和兩個(gè)特征子離子的精確質(zhì)量數(shù)以及在質(zhì)譜分析過程中發(fā)生的各種質(zhì)譜化學(xué)反應(yīng)，推斷出20種藥物的裂解途徑（見表2），從而使定性分析更為準(zhǔn)確。

3.2.2三重四極桿（QQQ）質(zhì)譜條件的優(yōu)化首先進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，在離子源ESI +電離方式下，芬氟拉明、苯丙醇胺、西布曲明、舍曲林、利莫那班、安非他酮、西酞普蘭、氟西汀、苯氟雷司、咖啡因、酚酞、布美他尼、托拉塞米、三氨喋啶、奧利司他、苯乙雙胍均可獲得較高豐度的 ＼[M+H＼]+準(zhǔn)分子離子峰；在離子源ESI

Symbolm@@ 電離方式下托吡酯、唑尼沙胺、大黃素、吲達(dá)帕胺可得到較高豐度的＼[M-H＼]

Symbolm@@ 準(zhǔn)分子離子峰。然后采用子離子掃描方式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，通過優(yōu)化碰撞能量，選擇豐度較高、干擾較小的兩對(duì)子離子為定性離子，其中峰度較高的作為定量離子，表1列出了的20種減肥藥物的質(zhì)譜離子以及優(yōu)化所得的串聯(lián)質(zhì)譜條件。

3.3提取條件的優(yōu)化

3.3.1提取溶劑的選擇對(duì)目標(biāo)物的提取效果取決于化合物的極性和樣品基質(zhì)的類型，實(shí)驗(yàn)涉及到食欲抑制劑、瀉藥、利尿劑、脂酶抑制劑、中樞興奮藥和雙胍類降糖藥6類藥物，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)差別較大，溶解性不同，分別溶于甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、丙酮，水等。選用單一萃取溶劑，不能保證這些減肥藥物的同時(shí)完全提取，同時(shí)由于氯仿和二氯甲烷不能與丙酮及水混溶，因此本實(shí)驗(yàn)選用了甲醇丙酮和乙醇丙酮二元體系作為提取溶劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，乙醇丙酮的提取效果較好。

3.3.2提取條件的選擇考察了不同比例乙醇丙酮（8∶2，7∶3，6∶4，5∶5， V/V）對(duì)于目標(biāo)物的提取效果。從圖2可見，提取溶劑為乙醇丙酮（7∶3， V/V）的提取效果較好。又比較了不同提取時(shí)間（5， 10， 15， 20， 25和30 min）和料液比（5， 10， 15， 20和25 mL/g）等條件下的提取效果，結(jié)果表明，料液比為10 mL/g，超聲提取15 min后，各種藥物的回收率較高，且節(jié)省了試劑和時(shí)間。3.3.3凈化條件的研究基質(zhì)分散固相萃取是一種簡單高效的凈化方法。伯仲胺（Primary secondary amine，PSA）吸附劑能有效去除樣本中的脂肪酸、極性色素、糖類物質(zhì)等極性基質(zhì)雜質(zhì)，ODS吸附劑能去除部分脂肪和脂溶性雜質(zhì)。減肥保健食品樣品多數(shù)是固體樣品，且樣品含糖量較高，對(duì)于減肥茶中茶多酚等極性成分的凈化選用PSA效果非常好；同時(shí)樣品中還含有大量脂溶性成分，ODS吸附劑可以達(dá)到凈化目標(biāo)物目的。本實(shí)驗(yàn)對(duì)添加PSA和ODS的量進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，添加300 mg PSA和250 mg ODS即可達(dá)到凈化效果，繼續(xù)添加樣液無明顯改善，且對(duì)回收率影響不大。

3.4樣品基質(zhì)效應(yīng)的消除

為消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測定產(chǎn)生的影響，保證方法的通用性和適用性，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)不同基質(zhì)的樣品進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，在減肥咖啡、減肥茶中由于存在大量多酚和堿類物質(zhì)，對(duì)20種減肥藥物有一定干擾；采用基質(zhì)分散固相萃取進(jìn)行凈化，排除干擾物質(zhì)，并結(jié)合調(diào)節(jié)流動(dòng)相的比例，使20種減肥藥物的出峰位置遠(yuǎn)離干擾物質(zhì)，從而消除了基質(zhì)效應(yīng)。減肥茶空白樣品及加標(biāo)樣品的TIC色譜圖見圖2。

3.5方法的線性方程、線性范圍和檢出限

配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在選定的色譜條件和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，由實(shí)驗(yàn)得出的線性方程，線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表3。采用空白樣品中添加目標(biāo)化合物的方法，按樣品前處理方法進(jìn)行處理和檢測，以3倍信噪比為方法檢出限（LOD），以10倍信噪比為方法定量限（LOQ）。20種減肥藥物的檢出限為0.05～3.0 mg/kg，定量限為

3.6方法的回收率和精密度

采用經(jīng)測定不含有目標(biāo)物的樣品進(jìn)行添加回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，樣品中添加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在不同水平范圍內(nèi)20種減肥藥物的回收率（每個(gè)添加濃度平行測定6次）為67.1%～101.4%（表4）。在日內(nèi)精密度均小于10%，日間（5 d）精密度均小于15%。

3.7樣品分析測定

應(yīng)用本方法對(duì)35種市售的減肥保健食品進(jìn)行了分析測定，其中15種樣品中均含有西布曲明，含量為2.43～28.29 g/kg；11種樣品中均含酚酞，含量為0.57～20.1 g/kg；9種樣品中均含咖啡因，含量為1.27～24.6 g/kg。結(jié)果表明，本方法具有快速簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好、適用性強(qiáng)，可滿足日常分析的需要。

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梁 祈， 黃文靜， 胡碧波， 馮 銳. 分析測試學(xué)報(bào)， 2013， 32（5）： 609-613

AbstractAn analytical method based on high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry has been developed for the simultaneous determination of 20 antiobesity drugs （fenfluramine， phenylpropanolamine， sibutramine， sertraline， rimonabant， bupropion， citalopram， fluoxetine， benfluorex， topiramate， zonisamide， caffeine， phenolphthalein， emodin， indapamide， bumetanide， torasemide， triamterene， orlistat， phenformin）. that were extracted from various weightloss functional foods by ethanol acetone（7∶3， V/V）and purified by primary secondary amine （PSA） and octadecyltrimethoxysilane（ODS） under ultrasonication. The analysis was carried out on HPLCMS /MS by electrospray ionization using multiple reaction monitoring after the chromatographic separation on Waters Atlantis T3 （3 μm， 150 mm × 2.1 mm） column. Identification was achieved by the retention time and the ion ratio， quantification was done by the external standard method. The limits of detection for the appetite suppressants were 0.05-3.0 mg/kg. The mean recoveries at the three spiked levels were 67.1%-101.4%， with the intraday precision less than 10% and the interday precision less than 15%. The method is reliable， accurate， reproducible and suitable for the determination of the antiobesity drugs in different weightloss functional foods.

KeywordsHigh performance liquid chromatography tandem mass spectrometry； Matrix solid phase dispersion； Weightloss functional foods； Mass spectrum fragmentation pathways

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AbstractAn analytical method based on high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry has been developed for the simultaneous determination of 20 antiobesity drugs （fenfluramine， phenylpropanolamine， sibutramine， sertraline， rimonabant， bupropion， citalopram， fluoxetine， benfluorex， topiramate， zonisamide， caffeine， phenolphthalein， emodin， indapamide， bumetanide， torasemide， triamterene， orlistat， phenformin）. that were extracted from various weightloss functional foods by ethanol acetone（7∶3， V/V）and purified by primary secondary amine （PSA） and octadecyltrimethoxysilane（ODS） under ultrasonication. The analysis was carried out on HPLCMS /MS by electrospray ionization using multiple reaction monitoring after the chromatographic separation on Waters Atlantis T3 （3 μm， 150 mm × 2.1 mm） column. Identification was achieved by the retention time and the ion ratio， quantification was done by the external standard method. The limits of detection for the appetite suppressants were 0.05-3.0 mg/kg. The mean recoveries at the three spiked levels were 67.1%-101.4%， with the intraday precision less than 10% and the interday precision less than 15%. The method is reliable， accurate， reproducible and suitable for the determination of the antiobesity drugs in different weightloss functional foods.

KeywordsHigh performance liquid chromatography tandem mass spectrometry； Matrix solid phase dispersion； Weightloss functional foods； Mass spectrum fragmentation pathways