基于PdAu納米顆粒的非標(biāo)記型凝血酶傳感器的研制

馮亞娟等

摘要采用電沉積方法將Pd納米顆粒沉積到玻碳電極（GCE）表面，再將Pd納米顆粒修飾電極插入H2SO4溶液中，吸收適量活性氫后，轉(zhuǎn)移到HAuCl4溶液中，靜置一定時(shí)間后，使金被活性氫還原并自發(fā)沉積到Pd 納米顆粒修飾的玻碳電極表面。通過自組裝作用將帶巰基的凝血酶適配體Ⅰ固定在PdAu/GCE表面，制得非標(biāo)記型凝血酶適配體傳感器。當(dāng)凝血酶與凝血酶適配體結(jié)合時(shí)，覆蓋在電極表面，從而阻礙了電極表面的PdAu納米顆粒對H2O2的催化還原活性，通過監(jiān)測H2O2還原電流的減小程度，實(shí)現(xiàn)對凝血酶的定量檢測?？疾炝藀H值、培育時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件對響應(yīng)電流的影響以及PdAu納米顆粒的協(xié)同作用。

1引言

適配體是由指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）＼[1＼]所篩選得到的功能性寡核苷酸短片段， 這些短核苷酸片段可用于靈敏、專一地檢測能與其有特異性結(jié)合的分子，如金屬離子、有機(jī)小分子化合物、代謝物和蛋白質(zhì)等＼[2，3＼]。與抗體相比，適配體具有明顯優(yōu)點(diǎn)，如保存容易、重現(xiàn)性好、容易修飾和方便再生等＼[4～6＼]。

凝血酶＼[7＼]是人體血液中一種重要的絲氨酸蛋白質(zhì)，在止血的生理和病理過程中起關(guān)鍵作用的蛋白水解酶。其在腦出血后的病理生理學(xué)過程中起重要作用，抑制凝血酶的活性對治療腦出血有重要的臨床意義＼[8，9＼]。因而檢測凝血酶對治療人體疾病具有重要價(jià)值?；陔娀瘜W(xué)生物傳感器檢測凝血酶被廣泛報(bào)道。Wang等＼[10＼]報(bào)道了一種標(biāo)記型的電化學(xué)適配體傳感器用來檢測凝血酶，主要是用凝血酶的兩段適配體與目標(biāo)物的特異性結(jié)合而形成“三明治”結(jié)構(gòu)，在其工作中，適配體I被FcSH/SiNCs標(biāo)記，適配體Ⅱ被固定在被鏈霉親和素修飾的磁珠一端。當(dāng)凝血酶出現(xiàn)時(shí)，適配體Ⅰ和適配體Ⅱ與凝血酶特異性結(jié)合形成一種的特殊的夾心結(jié)構(gòu)。其檢測線性范圍是0.1～5.0 nmol/L，檢出限為0.06 nmol/L。Huang等＼[11＼]研制了一種基于量子點(diǎn)標(biāo)記的電化學(xué)發(fā)光傳感器用來檢測凝血酶，在其檢測中，凝血酶適配體Ⅰ被固定在金電極上，適配體Ⅱ被量子點(diǎn)標(biāo)記，由于兩段適配體與同一個(gè)目標(biāo)物均有特異性結(jié)合，很容易形成“三明治”結(jié)構(gòu)，通過其結(jié)合后適配體構(gòu)型改變來檢測凝血酶的濃度。線性范圍是0～20 mg/L。Wang等[12]研制了一種將適配體固定在氧化石墨烯（GO）表面的電化學(xué)免疫適配體傳感器。通過物理吸附GO固定在玻碳電極或金電極表面，因氨基化的適配體與氧化石墨烯表面的COOH之間的化學(xué)鍵作用將適配體固定在石墨烯修飾電極的表面。將功能化的適配體分為兩段互補(bǔ)的一段通過內(nèi)嵌的方式包裹著Ru（phen）2+3，并作為探針。當(dāng)無凝血酶時(shí)，Ru（phen）2+3在電極表面?zhèn)鞲衅饔懈叩碾娦盘?；而加入凝血酶后，適配體與凝血酶特異性結(jié)合，Ru（phen）2+3被釋放電化學(xué)信號減弱，并以此在確定凝血酶的濃度，該傳感器的線性范圍是0.9 pmol/L～226 nmol/L。Yi等[13]研制了一種以核酸外切酶催化回收目標(biāo)物和酶催化的電化學(xué)適配體傳感器用于凝血酶的測定。在3巰丙基三甲氧基硅烷的表面大量的植入乙醇脫氫酶（ADH）后呈現(xiàn)出可變的多孔結(jié)構(gòu)，再將金納米顆粒固定在其表面用于催化NADH，為了提高電化學(xué)響應(yīng)信號，在daDNA的一端標(biāo)記亞甲基藍(lán)。當(dāng)凝血酶和Recjf的混合物出現(xiàn)時(shí)，凝血酶的適配體 Ⅰ和適配體 Ⅱ 特異性結(jié)合，此時(shí)核酸外切酶將凝血酶適配體Ⅱ從5′→3′方向降解，釋放凝血酶進(jìn)入溶液中，游離的凝血酶與適配體Ⅱ結(jié)合完成目標(biāo)物的回收和電化學(xué)信號的放大，該傳感器的線性范圍是5 pmol/L～100 nmol/L。然而，標(biāo)記型電化學(xué)適配體傳感器必須經(jīng)過一個(gè)復(fù)雜的修飾過程， 是標(biāo)記過程復(fù)雜且成本高。Du等＼[14＼]研制了一種基于負(fù)載二茂鐵的聚乙烯亞胺、DNA適配體以及碳納米管層層自組裝多層膜的無標(biāo)記型凝血酶適配體傳感器。該傳感器的線性范圍為0.3～165 μg/L，檢出限為0.14 μg/L。

本研究制備一種非標(biāo)記型電化學(xué)適配體傳感器，用于靈敏快速地檢測凝血酶。首先在玻碳電極表面采用電化學(xué)方法沉積PdAu納米顆粒，然后通過AuSH之間強(qiáng)力的鍵合作用，將凝血酶適配體Ⅰ固定在其表面；當(dāng)凝血酶與凝血酶適配體結(jié)合時(shí)，覆蓋在電極表面，從而阻礙了電極表面的PdAu納米顆粒對H2O2的催化還原活性，通過監(jiān)測H2O2還原電流的減小程度，實(shí)現(xiàn)對凝血酶的定量檢測。

3結(jié)果與討論

3.1PdAu納米顆粒的微觀形貌

采用SEM觀察PdAu 納米顆粒的微觀形貌（圖2），顆粒整齊地分散在GCE表面，平均粒徑約100 nm。微納米顆粒的催化作用跟其表面積大小有關(guān)。一般來說，納米顆粒的催化反應(yīng)是表面反應(yīng)，反應(yīng)主要與催化劑的表面積和活性中心有關(guān)[16]。顆粒半徑越小表面能越大，整體比表面積越大，催化效果越高。另外，當(dāng)粒子的大小在1～10 nm時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)量子效應(yīng)，成為量子化粒子，導(dǎo)致明顯禁帶變寬，從而使電子空穴對具有更強(qiáng)的氧化還原能力，催化活性將隨尺寸量子化程度的提高而增加。尺寸的量子化也使半導(dǎo)體獲得更大的電荷遷移速率，空穴與電子復(fù)合的幾率大大減小，也有利于提高催化反應(yīng)的效率。但同時(shí)大表面積也就意味著表面上出現(xiàn)復(fù)合中心的機(jī)會(huì)也越多，當(dāng)復(fù)合起主要作用時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)活性隨量子化程度的提高而下降的情況。對于H2O2的催化隨著粒徑的增大而減小。

3.3傳感器的電化學(xué)阻抗行為

電化學(xué)阻抗是檢測電極表面修飾狀態(tài)的常用工具，圖5為此傳感器制備過程各階段修飾電極在TrisHCl溶液中的交流阻抗圖。曲線a為裸GC電極的阻抗圖，近似一條直線，表明電子傳遞到電極表面只受擴(kuò)散控制。曲線b為Pd NPs/GC電極的阻抗圖，出現(xiàn)了較高的阻抗值Ret=450 kΩ。曲線c為PdAu NPs/GC電極的阻抗曲線，阻抗值Ret=400 kΩ， 主要是由于當(dāng)金納米顆粒修飾到電極上時(shí)，電極表面金屬納米顆粒的數(shù)量增加同時(shí)也就增加了電極表面與溶液之間電子的傳遞；曲線d分別為Thrombin aptamer Ⅰ/PdAu NPs復(fù)合膜修飾后的電極的阻抗曲線， Ret=800 kΩ，這是因?yàn)樾揎椛线m配體后電極表面形成了一層絕緣層。曲線e為Thrombin aptamerⅠ/PdAu NPs修飾后的電極結(jié)合目標(biāo)物凝血酶后的阻抗圖，

阻抗值劇增至Ret=1800 kΩ。這是由于絕緣的蛋白質(zhì)分子凝血酶與電極表面的適配體結(jié)合形成了體積較大的復(fù)合物，阻礙了電子傳遞，表明凝血酶已與電極上凝血酶適配體Ⅰ結(jié)合。

3.8回收率的測定

為考察此傳感器的實(shí)用性，本實(shí)驗(yàn)在稀釋10倍的人體血清樣品中進(jìn)行了凝血酶的回收率的測定， 結(jié)果見表1。平均回收率為98.5%，說明此傳感器能用于凝血酶的測定。

4結(jié)論

應(yīng)用電化學(xué)沉積的方法將PdAu納米顆粒修飾在玻碳電極表面，再將凝血酶適配體Ⅰ固定在其表面， 構(gòu)建了一種新型非標(biāo)記型適配體傳感器。當(dāng)凝血酶與適配體結(jié)合時(shí)，覆蓋在 PdAu表面。阻礙其催化H2O2的還原反應(yīng)。因此，H2O2的還原電流隨著凝血酶濃度的增大而減小，可實(shí)現(xiàn)對凝血酶的檢測。

References

1Qiu H J， Sun Y L， Huang X R， Qu Y B. Collid. Surf. B， 2010， 79（1）： 304-308

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邱翠翠， 張進(jìn)濤， 田 芳， 馬厚義， 電化學(xué)， 2008， 14（2）： 170-174

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17 Fang L Y， Wei H， Liu Z Z， Wang E K. Anal. Chim. Acta， 2008， 628（1）： 80-86

AbstractPd nanoparticles （Pd NPs） were electrodeposited on the glassy carbon electrode （GCE）. Then， Pd NPs/GCE was further inserted into H2SO4 solution to polarize for 5 min to absorb a certain amount of active hydrogen. Then， the electrode was quickly inserted to HAuCl4 solution for 15 min. AuNPs were deposited spontaneously on the surface of Pd NPs due to the reduction of active hydrogen. As a result， PdAuNPs were modified on the surface of GCE. Next， aptamer I of thrombin was immobilized on PdAu nanoparticles. In the presence of thrombin， it bound with the aptamer immobilized on PdAu nanoparticles and thus the formed complex obstructed the catalysis of PdAu nanoparticles to H2O2. Hence， the reduction current of H2O2 decreased with the increase of thrombin concentration. The aptamer sensor had a good linear relationship with the concentration of thrombin in the range of 2.98-297 nmol/L with a detection limit of 0.98 nmol/L.

KeywordsLabelfree； Aptasensor； Thrombin； Palladiumgold nanoparticles

阻抗值劇增至Ret=1800 kΩ。這是由于絕緣的蛋白質(zhì)分子凝血酶與電極表面的適配體結(jié)合形成了體積較大的復(fù)合物，阻礙了電子傳遞，表明凝血酶已與電極上凝血酶適配體Ⅰ結(jié)合。

3.8回收率的測定

為考察此傳感器的實(shí)用性，本實(shí)驗(yàn)在稀釋10倍的人體血清樣品中進(jìn)行了凝血酶的回收率的測定， 結(jié)果見表1。平均回收率為98.5%，說明此傳感器能用于凝血酶的測定。

4結(jié)論

應(yīng)用電化學(xué)沉積的方法將PdAu納米顆粒修飾在玻碳電極表面，再將凝血酶適配體Ⅰ固定在其表面， 構(gòu)建了一種新型非標(biāo)記型適配體傳感器。當(dāng)凝血酶與適配體結(jié)合時(shí)，覆蓋在 PdAu表面。阻礙其催化H2O2的還原反應(yīng)。因此，H2O2的還原電流隨著凝血酶濃度的增大而減小，可實(shí)現(xiàn)對凝血酶的檢測。

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AbstractPd nanoparticles （Pd NPs） were electrodeposited on the glassy carbon electrode （GCE）. Then， Pd NPs/GCE was further inserted into H2SO4 solution to polarize for 5 min to absorb a certain amount of active hydrogen. Then， the electrode was quickly inserted to HAuCl4 solution for 15 min. AuNPs were deposited spontaneously on the surface of Pd NPs due to the reduction of active hydrogen. As a result， PdAuNPs were modified on the surface of GCE. Next， aptamer I of thrombin was immobilized on PdAu nanoparticles. In the presence of thrombin， it bound with the aptamer immobilized on PdAu nanoparticles and thus the formed complex obstructed the catalysis of PdAu nanoparticles to H2O2. Hence， the reduction current of H2O2 decreased with the increase of thrombin concentration. The aptamer sensor had a good linear relationship with the concentration of thrombin in the range of 2.98-297 nmol/L with a detection limit of 0.98 nmol/L.

KeywordsLabelfree； Aptasensor； Thrombin； Palladiumgold nanoparticles

阻抗值劇增至Ret=1800 kΩ。這是由于絕緣的蛋白質(zhì)分子凝血酶與電極表面的適配體結(jié)合形成了體積較大的復(fù)合物，阻礙了電子傳遞，表明凝血酶已與電極上凝血酶適配體Ⅰ結(jié)合。

3.8回收率的測定

為考察此傳感器的實(shí)用性，本實(shí)驗(yàn)在稀釋10倍的人體血清樣品中進(jìn)行了凝血酶的回收率的測定， 結(jié)果見表1。平均回收率為98.5%，說明此傳感器能用于凝血酶的測定。

4結(jié)論

應(yīng)用電化學(xué)沉積的方法將PdAu納米顆粒修飾在玻碳電極表面，再將凝血酶適配體Ⅰ固定在其表面， 構(gòu)建了一種新型非標(biāo)記型適配體傳感器。當(dāng)凝血酶與適配體結(jié)合時(shí)，覆蓋在 PdAu表面。阻礙其催化H2O2的還原反應(yīng)。因此，H2O2的還原電流隨著凝血酶濃度的增大而減小，可實(shí)現(xiàn)對凝血酶的檢測。

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