C57BL/6小鼠PD-1基因敲除后心房肌細胞氧化應激水平和心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)研究

付國強 曹義戰(zhàn) 何乾鋒 田小溪 王伯良

·論著·

C57BL/6小鼠PD-1基因敲除后心房肌細胞氧化應激水平和心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)研究

付國強 曹義戰(zhàn) 何乾鋒 田小溪 王伯良

目的PD-1基因敲除后會激活T細胞并提高機體炎癥水平并可能影響機體氧化應激水平，本研究旨在觀察C57BL/6小鼠在PD-1基因敲除后心房細胞氧化應激水平變化及其對小鼠心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的影響。方法我們同時對兩組動物進行了觀察：C57BL/6小鼠和C57BL/6-PD-1-/-小鼠。對比觀察兩組心房肌細胞氧化應激水平和心房肌心肌纖維化水平。結(jié)果和對照組相比較，C57BL/6-PD-1-/-小鼠心房肌細胞細胞內(nèi)活性氧水平明顯升高，同時心房肌Masson染色顯示基因敲除后心房肌出現(xiàn)了纖維化，而對照組沒有出現(xiàn)。結(jié)論PD-1基因敲除后出現(xiàn)心房肌細胞活性氧水平的升高并導致了C57BL/6小鼠的心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)。

PD-1基因敲除；活性氧；心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)；心房顫動

房顫是臨床最常見的心律失常，在普通人群中的發(fā)病率約為2%，且隨著年齡的增長發(fā)病率迅速升高，80歲以上人群中發(fā)病率甚至超過了9%[1]。房顫的發(fā)病機制比較復雜，目前普遍認為房顫起源于存在于心房的多發(fā)折返環(huán)[2]，但對于多發(fā)折返環(huán)的產(chǎn)生機制仍然未得到完全闡明。近年來，有研究證實心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)能夠促進心房內(nèi)多發(fā)折返環(huán)生成而使得房顫發(fā)病的易感性增高[3]。氧化應激主要指在細胞代謝過程中所產(chǎn)生的對機體具有損害作用的活性氧(ROS)。有證據(jù)表明房顫患者的心房肌存在大量的氧化應激損傷[3]。房顫發(fā)病過程中的許多病理生理學改變可能和逐步升高的氧化應激水平有關(guān)，這些變化包括NAD(P)H氧化酶和黃嘌呤氧化酶活性的持續(xù)升高，炎癥過程加劇，RAS系統(tǒng)激活等。程序性死亡因子-1(programmed death-1，PD-1)是T細胞表面的CD28家族的一個重要的負性共刺激分子，該基因的缺失可以增強T細胞活性，提高體內(nèi)的炎癥水平[4]。目前有證據(jù)表明炎癥和氧化應激關(guān)系密切[5，6]。那么，伴隨著PD-1-/-小鼠機體的高炎癥狀態(tài)是否會影響小鼠心房肌細胞氧化應激水平并由此對小鼠心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)產(chǎn)生影響？在本研究中，我們對比了C57BL/6-PD-1-/-小鼠和C57BL/6小鼠心房肌氧化應激水平和心房心肌纖維化水平，旨在探究二者之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 C57BL/6-PD-1-/-小鼠由日本京都大學的Tasuku Honjo教授免費轉(zhuǎn)讓，實驗組(C57BL/6-PD-1-/-)和對照組(C57BL/6小鼠)每組15只，雄性，6～8周齡。實驗前均飼養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學基礎部神經(jīng)生物教研室SPF級實驗動物中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 Langendorff 灌注小鼠離體心臟獲取心房肌細胞：脫頸處死小鼠后迅速摘除心臟并主動脈插管，懸掛于Langendorff離體灌注儀上，通過主動脈實現(xiàn)冠狀動脈逆灌注，在冠狀動脈灌注過程中保持灌注液溫度在37℃并加入100%的氧氣。最初用普通的臺氏液灌注心臟清洗血液，然后用無鈣臺氏液灌注2 min，最后心臟用0.14 mg/ml膠原酶(Sigma-Aldrich)液灌注15 min左右，灌注結(jié)束后，心房被從心臟上分離下來剪成碎片，用玻璃移液管吹散這些碎片形成單個細胞。800 r/min離心5 min后，將細胞沉淀與含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基混勻，成纖維細胞差速貼壁1 h后換液，置于37℃培養(yǎng)箱以備后續(xù)試驗。

1.2.2 心房肌細胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測：取培養(yǎng)24 h的心房肌細胞，用0.1%胰酶1 ml滴于培養(yǎng)瓶，覆蓋瓶底，當細胞開始收縮棄去胰酶；PBS溫和清洗1次；放入2 ml無血清培養(yǎng)基；用彎頭吸管反復吹打，制備單個細胞懸液。心房肌細胞用無血清培養(yǎng)基清洗兩遍后，種植于96孔培養(yǎng)板，調(diào)整細胞濃度至106/ml，加用DMSO配置的濃度為2 μmol/L的DCFH-DA并在37℃培養(yǎng)箱中避光孵育20 min，后移入上樣管上機記錄數(shù)據(jù)。DCF的激發(fā)波長為495 nm，發(fā)射波長為525 nm，通過FL1檢測。

1.2.3 病理學檢查：心臟標本甲醛固定后，在70%乙醇中脫水，清洗后石蠟包埋。常規(guī)切片后在60℃烤箱中干燥，切片在Masson三色溶液(第四軍醫(yī)大學基礎部病理學實驗室)中浸入5 min，0.2%醋酸清洗10 s后用5%磷鎢酸處理10 min，然后用0.2%醋酸溶液再次清洗2次，2%苯胺藍溶液染色5 min，醋酸清洗2次后梯度酒精脫水后二甲苯清洗中性樹膠封片。

2 結(jié)果

2.1 心房肌細胞氧化應激水平檢測 通過流式細胞儀檢測心房肌細胞(每組10 000個)內(nèi)活性氧結(jié)果顯示，試驗組和對照組平均熒光強度差異有統(tǒng)計學意義[(30.2±1.7)vs(24.4±1.8),P<0.01]，C57BL/6-PD-1-/-小鼠組明顯升高。見圖1。

2.2 心房病理學檢查 心房肌Masson三色染色發(fā)現(xiàn)，在基因敲除組出現(xiàn)了心肌纖維化，而對照組未發(fā)現(xiàn)，在B組中可以看到染為藍色的膠原纖維，而A組中沒有看到。見圖2、3。

圖1 C57BL/6-PD-1-/-小鼠(B)和C57BL/6小鼠ROS檢測

3 討論

程序性死亡因子-1(programmed death-1，PD-1)是T細胞表面的CD28家族的一個重要的負性共刺激分子，它通過和其配體程序性死亡因子配體-1/2(programmed death ligand-1/2,PD-L1/2)結(jié)合后負性調(diào)節(jié)免疫反應并維持外周免疫耐受[7]。敲除該基因能夠增強T細胞活性，提高體內(nèi)的炎癥水平。1998年有學者[8]成功制作出了PD-1基因敲除小鼠，有研究證實PD-1-/-小鼠分泌炎性因子的能力明顯增強[9]。

(Masson×100)(Masson×200)(Masson×400)

(Masson×100)(Masson×200)(Masson×400)

氧化應激是指機體內(nèi)氧化和抗氧化失衡，導致某些自由基的產(chǎn)生和抗氧化防御之間出現(xiàn)嚴重失衡的一種病理狀態(tài)。在許多病理生理情況下，炎癥和氧化應激密切相關(guān)，高炎癥水平往往伴隨著高氧化應激水平，反之亦然。研究表明炎性因子可以通過白細胞膜上NADPH氧化酶復合物的氧化作用產(chǎn)生活性氧，放大氧化應激的反應[10]。有實驗證明：炎性細胞因子(IL-6，TNF-α)可直接誘導中性粒細胞產(chǎn)生大量氧自由基[11]，提高機體氧化應激水平。而氧自由基又可以進一步刺激炎性細胞活化，因此，氧化應激和炎性反應形成螺旋上升式的惡性循環(huán)。本研究表明，PD-1基因敲除小鼠本身伴隨的高炎癥狀態(tài)影響了小鼠心房肌細胞的氧化應激水平，使得其明顯身高。

氧化應激主要產(chǎn)物是對機體具有損害作用的活性氧(ROS)，高氧化應激水平和心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)密切相關(guān)，研究表明ROS在血管緊張素Ⅱ所誘導的心肌重構(gòu)中也發(fā)揮了重要作用[12]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)伴隨C57BL/6-PD-1-/-小鼠的機體高炎癥狀態(tài)導致了心房細胞氧化應激水平明顯升高，二者共同作用下導致了心房心肌纖維化形成。心肌纖維化被認為是心房重構(gòu)的主要表現(xiàn)，因此可以認為PD-1基因敲除后C57BL/6-PD-1-/-小鼠出現(xiàn)了心房肌細胞活性氧水平升高、心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)，由于心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)和房顫發(fā)病易感性的密切關(guān)系，實驗結(jié)果高度支持C57BL/6-PD-1-/-小鼠房顫發(fā)病易感性升高。

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ThechangesofoxidativestresslevelsofatrialmusclecellandatrialstructureremodelingafterPD-1geneknock-outinC57BL/6mice

FUGuoqiang,CAOYizhan,HEQianfeng,etal.DepartmentofEmergency,TangduHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710038,China

ObjectiveTo investigate the changes of oxidative stress levels of atrial muscle cell and effect on atrial structure remodeling after programmed cell death 1(PD-1) gene knock-out in C57BL/6 mice.MethodsThe two kinds of mice were enrolled in the study:C57BL/6 control group (15 mice,including 6 males and 9 females ) and C57BL/6-PD-1 group (15 mice,including 6males and 9 females).The oxidative stress levels of atrial muscle cell and atrial myocardial fibrosis were observed for both groups.ResultsAs compared with those in C57BL/6 control group,the oxidative stress levels of atrial muscle cell in PD-1 group were significantly increased (P<0.05),meanwhile,Masson staining showed that atrial myocardial fibrosis was found in PD-1 group,however,which was not observed in C57BL/6 control group.ConclusionThe increase of oxidative stress levels of atrial muscle cell presents after PD-1 gene knock-out in C57BL/6 mice,furthermore,which results in atrial structure remodeling of C57BL/6 mice.

PD-1 deficiency；reactive oxygen species；atrial structure remodeling；atrial fibrillation

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.15.005

710038 西安市，第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院急診科

王伯良，710038 西安市，第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院急診科；

E-mail：wliang@fmmu.edu.cn

R 541.75

A

1002-7386(2014)15-2256-03

2014-01-22)