銀屑病患者血清IL-26蛋白和全血Th17細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的測(cè)定

韋利強(qiáng)，秦東春，徐武生

1河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科 鄭州 450052

銀屑病患者血清IL-26蛋白和全血Th17細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的測(cè)定

韋利強(qiáng)1)，秦東春2)#，徐武生3)

1河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科 鄭州 450052

#通訊作者，男，1963年12月生，博士，主任技師，研究方向：腫瘤與分子免疫學(xué)，E-mail:qindongchun@zzu.edu.cn

IL-26；Th17細(xì)胞；皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)；銀屑病

銀屑病是一種慢性、反復(fù)發(fā)作的自身免疫性皮膚病，其確切的病因不明，與基因、激素、環(huán)境和感染因素有關(guān)。銀屑病病變組織可見(jiàn)大量活化的T細(xì)胞、異常增殖的角質(zhì)形成細(xì)胞和浸潤(rùn)性白細(xì)胞[1]。研究[2]發(fā)現(xiàn)浸潤(rùn)的T細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞以及其分泌的細(xì)胞因子在疾病的發(fā)生中扮演重要的角色。在病變皮膚組織中可見(jiàn)大量Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如TNF-α、IFN-γ和IL-1β，所以一直認(rèn)為T(mén)h1細(xì)胞在銀屑病中起主導(dǎo)作用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)一種新的T細(xì)胞亞群Th17細(xì)胞，其可合成IL-17和IL-22。IL-17和IL-22可參與銀屑病的發(fā)病過(guò)程，是銀屑病發(fā)生中重要的炎癥細(xì)胞因子。除了可以分泌IL-17和IL-22之外，Th17細(xì)胞還可合成IL-26[3]。該研究測(cè)定銀屑病患者血清IL-26蛋白水平，分析IL-26水平與銀屑病嚴(yán)重程度的關(guān)系，同時(shí)檢測(cè)不同類(lèi)型銀屑病患者全血中Th17細(xì)胞因子(IL-17A、IL-22和IL-26)mRNA的表達(dá)水平，報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象入選病例為鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2012年12月至2013年5月皮膚科住院部收治的加重期銀屑病患者47例，其中男19例，女28例；尋常型15例，膿皰型12例，紅皮型11例，關(guān)節(jié)型9例。所有銀屑病患者均由2名以上副主任及以上技術(shù)職稱(chēng)醫(yī)師確診?；颊呓?周內(nèi)未外用糖皮質(zhì)激素、維生素衍生物、他克莫司等藥物，2周內(nèi)未行光線(xiàn)療法或光化學(xué)療法治療，1個(gè)月內(nèi)未口服維酸類(lèi)、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等藥物，無(wú)系統(tǒng)性紅斑狼瘡等其他免疫性皮膚病及重要臟器器質(zhì)性病變，采血前檢查血常規(guī)、肝功能、腎功能均無(wú)異常。健康對(duì)照組為鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心的47例健康體檢者，采集血樣前1個(gè)月內(nèi)無(wú)感染情況，既往無(wú)銀屑病、血管炎等免疫相關(guān)性皮膚病病史。該研究經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的審查并獲得批準(zhǔn)同意。每位研究對(duì)象(包括病例與對(duì)照)在正式參加研究前均必須簽署知情同意書(shū)，方可為正式研究對(duì)象，確保了該研究符合赫爾辛基倫理原則要求。銀屑病組年齡(33.5±16.9)歲，患病時(shí)間(4.6±3.6) a，皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)(PASI)為(12.12±3.02)。健康對(duì)照組年齡、性別與銀屑病組相匹配。

1.2主要試劑和儀器IL-26 ELISA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD公司)、RNAiso Plus(日本TaKaRa公司)、SuperQuickRT MasterMix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和UltraSYBR Mixture(北京康為世紀(jì)公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)、酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-RAD公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Heal Force公司)。

1.3 2組血清IL-26蛋白的測(cè)定采集靜脈血2 mL，EDTA-K3抗凝，混勻。2組血清IL-26水平用IL-26 ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。IL-26 ELISA檢測(cè)試劑盒的測(cè)定范圍為8～1 000 ng/L。用酶標(biāo)儀測(cè)定A值，測(cè)定波長(zhǎng)為450 mm。

1.4 2組全血Th17細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的測(cè)定

1.4.1 總RNA提取 吸取全血100 μL，與RNAiso Plus 200 μL一起置于1.8 mL離心管中，加入氯仿，混勻，室溫靜置5 min， 于4 ℃ 12 000g離心15 min。吸取上清液至另一個(gè)1.8 mL離心管中，加入異丙醇，充分混勻，室溫放置10 min后， 于4 ℃ 12 000g離心10 min。棄去上清，緩慢沿管壁加入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇750 μL，于4 ℃ 12 000g離心5 min。棄去所有上清，在超凈工作臺(tái)中干燥沉淀5 min。加入無(wú)RNA酶的去離子水完全溶解RNA沉淀后，溶解液置于紫外分光光度儀中進(jìn)行測(cè)定，讀取260與280 nm的A值，利用A(260 nm)/A(280 nm)比值估計(jì)核酸的純度，A(260 nm)/A(280 nm)比值控制在1.8～2.0。

1.4.2 RNA樣本反轉(zhuǎn)錄 利用SuperQuickRT MasterMix進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄。按照試劑盒提供的反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。-20 ℃保存。

1.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 利用UltraSYBR Mixture對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，總反應(yīng)體積為50 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的正義鏈和反義鏈分別如下。β-actin：5’-TGAGATGGCCTCAGGTGGTA-3’，5’-CGGGCAGGCAGAATAGAGAC-3’；IL-17A：5’-AGAGATATCCCTCTGTGATC-3’，5’-TACCCCAAAGTTATCTCAGG-3’；IL-22，5’-ACAGCAAATCCAGTTCTCCAA-3’，5’-TC CAGAGGAATGTGCAAAAG-3’；IL-26：5’-GGCAGAAATTGAGCCACTGT-3’，5’-TCCAGTTCACTGATGGCTTTG-3’。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性，95 ℃ 10 min；然后95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，60 ℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)；溶解曲線(xiàn)分析，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。以β-actin作為內(nèi)參，結(jié)果以2-ΔCt表示，ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有連續(xù)性變量均符合正態(tài)分布，方差齊同。銀屑病組和健康對(duì)照組之間血清IL-26蛋白水平和IL-17A、L-22、IL-26 mRNA表達(dá)水平的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；銀屑病患者血清IL-26水平與PASI的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析；不同類(lèi)型銀屑病患者間全血IL-17A、IL-22、IL-26 mRNA表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1銀屑病組和健康對(duì)照組血清IL-26蛋白水平及全血IL-17A、IL-22、IL-26mRNA的表達(dá)水平與健康對(duì)照組比較，銀屑病組血清IL-26蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)銀屑病組全血IL-17A、IL-22和IL-26 mRNA表達(dá)水平亦升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.2銀屑病患者血清IL-26蛋白水平與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性銀屑病患者血清IL-26蛋白水平與PASI呈正相關(guān)(r=0.684,P<0.001)。

2.3不同類(lèi)型銀屑病患者全血IL-17A、IL-22、IL-26mRNA表達(dá)水平見(jiàn)表2。不同類(lèi)型銀屑病患者全血IL-17A和IL-22 mRNA 表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但I(xiàn)L-26 mRNA表達(dá)水平在不同類(lèi)型銀屑病患者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且與尋常型、膿皰型和紅皮型患者比較關(guān)節(jié)型患者IL-26 mRNA表達(dá)水平升高，而尋常型、膿皰型、紅皮型患者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 銀屑病組和健康對(duì)照組血清IL-26蛋白水平及全血IL-17A、IL-22、IL-26 mRNA表達(dá)水平的比較

表2 不同類(lèi)型銀屑病患者全血IL-17A、IL-22、IL-26 mRNA表達(dá)水平

*:與關(guān)節(jié)型組比較，P<0.05。

3 討論

該研究發(fā)現(xiàn)銀屑病患者血清IL-26蛋白水平升高，并與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。目前關(guān)于IL-26生物學(xué)功能的報(bào)道不多。Dambacher等[4]報(bào)道Crohn病患者血清中IL-26水平升高，并能誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞分泌TNF-α和IL-8。最近，Corvaisier等[5]發(fā)現(xiàn)IL-26在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的血清和關(guān)節(jié)腔積液中均升高，并能促進(jìn)單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生IL-8、TNF-α等細(xì)胞因子。IL-26在銀屑病中的作用機(jī)制仍然不清楚。IL-26受體(IL-20R1和IL-10R2)表達(dá)于皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞表面，并能誘導(dǎo)其產(chǎn)生IL-8[6]。這可能是IL-26參與銀屑病發(fā)病過(guò)程的一種機(jī)制。

同時(shí)作者分析了不同類(lèi)型銀屑病患者全血Th17細(xì)胞因子mRNA表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)IL-17A和IL-22 mRNA表達(dá)水平在不同類(lèi)型銀屑病患者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，關(guān)節(jié)型銀屑病患者全血中IL-26 mRNA表達(dá)水平高于其他類(lèi)型銀屑病患者。這可能是由于除了Th17細(xì)胞分泌IL-26，關(guān)節(jié)型銀屑病患者病變關(guān)節(jié)腔的滑膜細(xì)胞也可以分泌IL-26[5]。銀屑病患者病變組織中的IL-17A與IL-22均升高[7]，這與作者發(fā)現(xiàn)的銀屑病患者全血中IL-17A、IL-22和IL-26 mRNA表達(dá)水平升高是一致的。目前對(duì)IL-17和IL-22的生物學(xué)功能已有深入研究，但是IL-26的生物學(xué)功能仍不清。IL-17又包括IL-17A、IL-17E和IL-17F等，其中以IL-17A為主。IL-17A能激活NF-κB和MAPK信號(hào)途徑，引起多種效應(yīng)，主要效應(yīng)為誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的活化和聚集，同時(shí)還能抑制炎癥組織的中性粒細(xì)胞凋亡。IL-17A還可以通過(guò)刺激血管生成素和基質(zhì)金屬酶產(chǎn)生，從而促進(jìn)組織的血管生成和修復(fù)。除此之外，IL-17A還能與TNF-α起協(xié)同作用，促進(jìn)IL-6、IL-1β和TNF-α釋放，加劇炎癥進(jìn)程。但是，IL-17A不能刺激角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖[8]。IL-22也是Th17細(xì)胞產(chǎn)生的重要炎癥細(xì)胞因子。與IL-17A不同，IL-22能促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。IL-22能夠刺激角質(zhì)形成細(xì)胞分泌抗微生物氨基酸肽，同時(shí)也能促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬酶，并且銀屑病病變組織和血漿中IL-22的含量與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[9]。鑒于IL-22與IL-26擁有一定相似的氨基酸序列，都屬于IL-10細(xì)胞因子家族，且二者均可由Th17細(xì)胞產(chǎn)生，IL-26是否具有與IL-22相似的生物學(xué)功能有待于進(jìn)一步的研究。

雖然該研究證實(shí)了IL-26水平在銀屑病患者中升高，且在關(guān)節(jié)型銀屑病患者中高于其他類(lèi)型的銀屑病患者，并與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)；提示IL-26可成為銀屑病，尤其是關(guān)節(jié)型銀屑病診斷及治療、監(jiān)測(cè)的輔助指標(biāo)。但是該研究仍有不足之處，如樣本量偏少，未對(duì)IL-26在銀屑病中的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入的研究。所以IL-26要成為關(guān)節(jié)型銀屑病的臨床輔助診斷指標(biāo)以及新的治療靶點(diǎn)，仍需要擴(kuò)大樣本量，同時(shí)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，以進(jìn)一步揭示IL-26在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的確切作用。

[1]Chandran V,Raychaudhuri SP.Geoepidemiology and environmental factors of psoriasis and psoriatic arthritis[J].J Autoimmun,2010,34(3):J314

[2]Zhu K,Ye J,Wu M,et al.Expression of Th1 and Th2 cytokine-associated transcription factors, T-bet and GATA-3, in peripheral blood mononuclear cells and skin lesions of patients with psoriasis vulgaris[J].Arch Dermatol Res,2010,302(7):517

[3]Donnelly RP,Sheikh F,Dickensheets H,et al.Interleukin-26: an IL-10-related cytokine produced by Th17 cells[J].Cytokine Growth Factor Rev,2010,21(5):393

[4]Dambacher J,Beigel F,Zitzmann K,et al.The role of the novel Th17 cytokine IL-26 in intestinal inflammation[J].Gut,2009,58(9):1207

[5]Corvaisier M,Delneste Y,Jeanvoine H,et al.IL-26 is overexpressed in rheumatoid arthritis and induces proinflammatory cytokine production and Th17 cell generation[J].PLoS Biol,2012,10(9):e1001395

[6]Braum O, Pirzer H, Fickenscher H. Interleukin-26, a highly cationic T-cell cytokine targeting epithelial cells[J].Antiinflamm Antiallergy Agents Med Chem, 2012, 11(3):221

[7]Res PC,Piskin G,de Boer OJ,et al.Overrepresentation of IL-17A and IL-22 producing CD8 T cells in lesional skin suggests their involvement in the pathogenesis of psoriasis[J].PLoS One,2010,5(11):e14108

[8]Martin DA,Towne JE,Kricorian G,et al.The emerging role of IL-17 in the pathogenesis of psoriasis: preclinical and clinical findings[J].J Invest Dermatol,2013,133(1):17

[9]Fujita H. Role of IL-22 in the pathogenesis of skin diseases[J]. Nihon Rinsho Men’eki Gakkai Kaishi, 2011, 35(3):168

(2013-10-11收稿 責(zé)任編輯姜春霞)

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.044