內(nèi)皮素-1對小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞環(huán)氧化酶-2、前列腺素E2表達的影響

李巖琦，趙源征，高靈利，劉恒方#

1)鄭州大學(xué)醫(yī)院內(nèi)科 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

內(nèi)皮素-1對小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞環(huán)氧化酶-2、前列腺素E2表達的影響

李巖琦1)，趙源征2)，高靈利2)，劉恒方2)#

1)鄭州大學(xué)醫(yī)院內(nèi)科 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

﹟通訊作者，男，1965年8月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：腦血管病，E-mail：liuhf1965@163.com

內(nèi)皮素-1；環(huán)氧化酶-2；前列腺素E2；腦微血管內(nèi)皮細胞；小鼠

目的：探討內(nèi)皮素-1(ET-1)對小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞中環(huán)氧化酶-2(COX-2)及前列腺素E2(PGE2)表達的影響。方法培養(yǎng)小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞bEnd.3株，分別加入不同濃度(1、10、100和1 000 nmol/L)的ET-1處理2、4、6、16和24 h，用Western blot技術(shù)檢測不同濃度ET-1處理不同時間后細胞內(nèi)COX-2表達的變化；另取生長良好的細胞與10 nmol/L的ET-1在37 ℃下分別培養(yǎng)2、4、6、16和24 h，以不加ET-1培養(yǎng)的細胞為對照，檢測各組細胞上清液中PGE2水平的變化。結(jié)果bEnd.3細胞經(jīng)不同濃度ET-1處理不同時間后，COX-2蛋白表達在2～4 h時顯著增加，6 h時達到高峰，具有濃度及時間依賴性(F濃度=127.079，F(xiàn)時間=40.158，F(xiàn)交互=5.783，P均<0.001)。10 nmol/L的ET-1處理不同時間后各組bEnd.3細胞上清液中PGE2釋放水平于4 h開始升高，6 h達峰，24 h下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=195.630，P<0.001)。結(jié)論ET-1可上調(diào)bEnd.3細胞中炎癥因子COX-2的表達及PGE2的釋放，最終對bEnd.3細胞株造成損傷。

腦內(nèi)的毛細血管和微血管內(nèi)皮細胞在維持腦血流、微血管張力和血腦屏障功能中起重要作用。有研究[1]表明，內(nèi)皮細胞過度表達內(nèi)皮素-1(endothelin-1, ET-1)可加重腦缺血。同時，在腦缺血缺氧時，內(nèi)皮細胞和星形膠質(zhì)細胞也產(chǎn)生ET-1[2]。一些研究[3]還表明，體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞能產(chǎn)生和釋放ET-1，可以引發(fā)血管收縮和前炎癥反應(yīng)。因此，ET-1通過在腦微血管內(nèi)皮細胞中的作用，可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用，但其確切的作用機制仍不清楚。該研究通過體外培養(yǎng)小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞，觀察ET-1對環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)表達及前列腺素E2(protaglandin E2,PGE2)釋放的影響。

1 材料與方法

1.1主要儀器及試劑DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、Trizol購自Invitrogen公司，硝酸纖維素膜和增強化學(xué)發(fā)光Western blot檢測系統(tǒng)購自GE公司，各種抗體均購自Santa Cruz公司，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白分析試劑購自Pierce公司，ET-1、各種酶類及其他化學(xué)試劑均購自Sigma公司。

1.2小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞株bEnd.3購自賽爾生物技術(shù)有限公司(中國)。加入含100 g/L PBS、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素和250 μg/L兩性霉素B DMEM/F-12的培養(yǎng)基，在37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)至細胞融合成片時，用0.5 g/L胰島素/0.53 mmol/L EDTA將其洗脫。將細胞懸液(2×105mL-1)接種于6孔培養(yǎng)板(2 mL/孔)，用來測量蛋白的表達。24 h后更換培養(yǎng)基，隨后每3 d更換一次。

1.3bEnd.3細胞中COX-2蛋白表達的Westernblot檢測生長良好的細胞與不同濃度(1、 10、100 和1 000 nmol/L)的ET-1在37 ℃下分別孵育2、4、6、16和24 h。細胞經(jīng)冰冷的PBS洗脫，小心刮下細胞，4 ℃下45 000g離心1 h，棄上清液。樣本被轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，加入COX-2抗體孵育過夜。TTBS洗膜4次，5 min/次，加入1:2 000稀釋的抗兔辣根過氧化物酶抗體，孵育2 h后用增強化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測蛋白的表達情況。每組均設(shè)3個平行對照。

1.4bEnd.3細胞上清液中PGE2水平檢測細胞培養(yǎng)同1.2。取生長良好的細胞與10 nmol/L的ET-1在37 ℃下分別培養(yǎng)2、4、6、16和24 h，以不加ET-1培養(yǎng)的細胞為對照。細胞經(jīng)低速離心后取上清，利用酶聯(lián)免疫試劑盒(博奧森生物科技公司)檢測各組細胞上清液中PGE2水平。每組均設(shè)3個平行對照。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0進行分析。應(yīng)用4×5析因設(shè)計的方差分析比較不同濃度ET-1培養(yǎng)bEnd.3細胞不同時間后細胞中COX-2蛋白表達的變化，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較10 nmol/L ET-1培養(yǎng)bEnd.3細胞不同時間后細胞上清液中PGE2水平的變化，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1不同濃度ET1培養(yǎng)bEnd.3細胞不同時間后細胞中COX-2蛋白表達的變化見表1。由表1可知COX-2蛋白表達在2～4 h時增加，6 h時達到高峰，具有濃度及時間依賴性。

表1 不同濃度ET-1培養(yǎng)bEnd.3細胞不同時間后細胞中COX-2蛋白表達的變化(n=3)

F組間=127.079，F(xiàn)時間=40.158，F(xiàn)交互=5.783，P均<0.001。

2.2 10nmol/LET-1培養(yǎng)bEnd.3細胞不同時間后細胞上清液中PGE2水平的變化與對照組[(278.43±0.05) ng/L]相比，ET-1培養(yǎng)2、4、6、16和24 h后細胞上清液中PGE2水平分別為[(441.52±0.07)、(567.70±0.07)、(618.85±0.09)、(539.83±0.07)和(460.61±0.07) ng/L]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=195.630，P<0.001)。結(jié)果顯示PGE2水平于4 h開始升高，6 h達峰，24 h顯著下降(P<0.05)，具有時間依賴性。

3 討論

腦微血管內(nèi)皮細胞是構(gòu)成血腦屏障的重要基礎(chǔ)，各種有害因素如缺氧等均可導(dǎo)致其功能異常，而血管內(nèi)皮細胞功能損傷是缺血性腦卒中的早期病變與基本病因之一。研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，ET-1是血管內(nèi)皮細胞分泌、含21個氨基酸殘基的多肽，具有強烈的縮血管作用，當血管內(nèi)皮細胞受到損害時可使ET-1分泌增加，反之，ET-1升高可破壞內(nèi)皮細胞，且ET-1的增加可使腦血流量降低至病理水平。COX是合成前列腺素(PGs)的關(guān)鍵限速酶，能催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為PGs。COX存在2種亞型：COX-1存在于大多數(shù)組織，間接維持生理反應(yīng)及血管內(nèi)平衡；COX-2在大多數(shù)正常組織和細胞中不能被檢測出，但當血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞發(fā)生炎癥反應(yīng)時，可被細胞因子、內(nèi)皮素及PGs誘導(dǎo)產(chǎn)生[6]。

研究[7]發(fā)現(xiàn)，上調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的COX-2水平，可將花生四烯酸催化代謝成各種PGs產(chǎn)物，從而加重神經(jīng)變性疾病的炎癥反應(yīng)。而有文獻[8]報道在一些細胞內(nèi)，ET-1能夠通過MAPK途徑上調(diào)COX-2的表達。作者采用Western blot方法檢測bEnd.3細胞中不同濃度ET-1培養(yǎng)不同時間后COX-2蛋白表達的變化，結(jié)果顯示，bEnd.3細胞在不同濃度ET-1處理后，COX-2蛋白2～4 h時增加，6 h時達到高峰，表明ET-1能夠上調(diào)COX-2表達，且呈濃度和時間依賴性。而COX-2表達的增加可使微血管的通透性增加，促進單核細胞黏附及聚集、巨噬細胞遷移，激發(fā)炎癥因子如IL-6等的產(chǎn)生，致使炎癥級聯(lián)反應(yīng)擴大。另有研究[9]也發(fā)現(xiàn)COX-2在正常生理情況下幾乎是不表達的，只有一定的條件刺激，才可使COX-2過度表達?？梢姡欢舛鹊腅T-1培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細胞株bEnd.3可通過上調(diào)炎癥因子COX-2的表達，致使腦微血管內(nèi)皮細胞損傷。

另外，該研究結(jié)果顯示ET-1為10 nmol/L時最有意義。研究[10]發(fā)現(xiàn)COX 是作為催化花生四烯酸生成PGs類物質(zhì)的限速酶，從COX酶活性增高到PGE2合成與釋放需要一定的時間。作者采用酶聯(lián)免疫法檢測10 nmol/L ET-1培養(yǎng)不同時間bEnd.3細胞后發(fā)現(xiàn)細胞上清液中PGE2的釋放水平于4 h開始升高，6 h達峰，24 h顯著下降；且不同濃度ET-1刺激下COX-2表達的峰值與PGE2釋放的峰值時一致；表明ET-1能夠促進PGE2的釋放，且呈時間依賴性。提示一定濃度的ET-1培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細胞株bEnd.3能夠促進PGE2的釋放，進而加重血管內(nèi)皮細胞的損傷。

總之，該研究結(jié)果表明一定濃度的ET-1培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細胞株bEnd.3能夠上調(diào)炎癥因子COX-2的表達及促進PGE2的釋放，進而損傷腦微血管內(nèi)皮細胞功能，最終引發(fā)腦血管病事件。提示ET-1可能在腦血管炎癥反應(yīng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)其他疾病中發(fā)揮重要作用，開發(fā)以COX-2/PGE2為靶點的藥物，可能為治療腦損傷及損傷后炎癥反應(yīng)提供新的思路。

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(2013-12-17收稿 責(zé)任編輯趙秋民)

Effect of endothelin-1 on mice brain microvascular endothelial cells cyclooxygenase-2 and prostaglandin E2 expresstion

LIYanqi1),ZHAOYuanzheng2),GAOLingli2),LIUHengfang2)

1)DepartmentofInternalMedicine,theHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)DepartmentofNeurology,theFifthAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

endothelin-1;cyclooxygenase-2;prostaglandin E2;brain microvascular endothelial cell;mouse

Aim: To explore the effects of endothelin-1 (ET-1) on the expression of cyclooxygenase-2 (COX-2) and prostaglandin E2 (PGE2) in the mice brain microvascular endothelial cell. Methods: The bEnd.3 cells，a mice brain microvascular endothelial cell line，were added to 1, 10, 100 or 1 000 nmol/L ET-1 in treatment for 2, 4, 6, 16 or 24 h. Different concentrations ET-1 treated with different time COX-2 expression was detected by Western blot; another well-grown cells and 10 nmol/L ET-1 were cultured 2, 4, 6, 16 and 24 h at 37 ℃, the cultured cells without ET-1 treatment was used as control. The changes of PGE2 levels in culture supernatants were detected in each group. Results: Compared with control group, the protein expressions of COX-2 were significantly increased at 2 to 4 h and reached the peak at 6 h, with a concentration- and time-dependent manner(Fconcentration=127.079，F(xiàn)time=40.158，F(xiàn)interaction=5.783，P<0.001); the level of PGE2 were significantly increased at 4 h, reached the peak at 6 h, then were significantly decreased at 24 h after being treated by 10 nmol/L ET-1 in each group bEnd.3 cell supernatant at different times(F=195.630，P<0.001). Conclusion: ET-1 may up-regulate COX-2 expression and PGE2 release in bEnd.3 cells, ultimately cause damage to bEnd.3 cell lines.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.021

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