TLR4與NF-κB蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

高勝利,徐亮亮,龐作良

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 胸外科,新疆 烏魯木齊,830011)

目前，肺癌已成為全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，而肺部的不正常炎性過程可能與肺癌的發(fā)生及發(fā)展具有一定相關(guān)性。Toll樣受體4(TLR4)是與炎癥、腫瘤關(guān)系最為密切的TLR家族成員之一，也是參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質(zhì)分子，是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁[1]。TLR為單個高度保守Ⅰ型跨膜非催化性蛋白質(zhì)，當(dāng)微生物突破機(jī)體皮膚、黏膜等物理屏障時，其可識別微生物本身所具有的保守性微結(jié)構(gòu)，并激活機(jī)體產(chǎn)生免疫細(xì)胞應(yīng)答。TLR誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和腫瘤主要是通過MyD88的依賴性途徑及核因子κB信號途徑來啟動細(xì)胞活化進(jìn)程，調(diào)控樹突狀細(xì)胞(DC)的成熟和免疫正向調(diào)節(jié)分子的表達(dá)[2]。由于腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中可產(chǎn)生一些能被TLR識別的內(nèi)源性配體，因此TLR在腫瘤免疫監(jiān)視中可能發(fā)揮了一定作用。

核因子-κB(NF-κB)是具有多向性調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控多種基因(免疫、炎癥反應(yīng)、病毒和原癌基因)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。而激活的NF-κB參與癌癥的啟動、發(fā)生及發(fā)展過程，在炎癥性相關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展中呈高表達(dá)，且在炎癥與癌變間起橋梁作用[3]。本研究采用免疫組化SP法分析非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織中TLR4與NF-κB蛋白水平的表達(dá)，并探討其在NSCLC發(fā)生發(fā)展過程中的可能機(jī)制及與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2007年1月—2010年12月在本院行完全性手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的NSCLC標(biāo)本58例，所有患者術(shù)前均未接受放療或化療，癌旁組織距離癌組織邊緣5 cm以上，且病理證實(shí)為正常肺組織。其中男47例，女11例；年齡45～76歲，中位年齡66.5歲；吸煙指數(shù)>400支/年36例，<400支/年22例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例。術(shù)后病理分期按2007年世界衛(wèi)生組織(WHO)國際抗癌聯(lián)盟制定的肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，并參考《外科診斷病理學(xué)》進(jìn)行命名及分類，其中腺癌31例，鱗癌26例，腺鱗癌1例；高分化癌15例，中分化癌31例，低分化癌和未分化癌12例。根據(jù)2009年國際肺癌研究學(xué)會(IASLC)第7版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn): Ⅰ期15例，Ⅱ期22例，Ⅲ期21例。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑：兔抗人TLR4多克隆抗體購自上海研卉生物科技有限公司，兔抗人NF-κB多克隆抗體購自天津津脈公司,SP免疫組化試劑盒購自北京中杉公司。

1.2.2 試驗(yàn)方法：采用免疫組化SP法，染色程序嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。用已知TLR4和NF-κB陽性切片作陽性對照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作空白對照。經(jīng)DAB顯色、復(fù)染、脫水，中性樹膠封片后編號，常規(guī)脫蠟、水化的組織切片按WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)由病理科同一組醫(yī)師進(jìn)行診斷和病理分級。

1.3 評定標(biāo)準(zhǔn)

TLR4在NSCLC癌組織和癌旁組織中均以細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜呈棕黃色或棕褐色為陽性。NF-κB在NSCLC癌組織和癌旁組織中的表達(dá)主要表現(xiàn)為胞漿或細(xì)胞核中有棕褐色或棕黃色顆粒沉淀。染色強(qiáng)度分為(-)級：著色區(qū)內(nèi)無棕黃色顆粒或呈均勻一致淡黃色，與背景一致; (+)級：著色區(qū)內(nèi)可見少量淡黃色顆粒，明顯高于背景或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，可見較多深棕色顆粒; (2+)級：著色區(qū)內(nèi)可見大量深棕色顆粒。

2 結(jié) 果

2.1 NSCLC組織和癌旁組織中TLR4及NF-κB蛋白表達(dá)

TLR4和NF-κB蛋白在NSCLC組織中的陽性表達(dá)率(60.3%和67.2%)明顯高于癌旁正常肺組織中的陽性表達(dá)率(15.5%和8.6%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表1。

表1 TLR4和NF-κB蛋白在NSCLC組織和癌旁正常肺組織中的表達(dá)[n(%)]

2.2 NSCLC組織中TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

在NSCLC低、中、高分化組織中TLR4蛋白陽性表達(dá)率分別為83.3%、67.7%和26.7%,兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。NSCLC不同組織學(xué)類型中NF-κB蛋白陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且在腺癌中的陽性率(80.6%)明顯高于鱗癌(51.9%)。見表2、圖1。

表2 NSCLC組織中TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

圖1 NF-κB蛋白在NSCLC組織中的表達(dá) 400倍

2.3 NSCLC組織中TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)相關(guān)性分析

39例NF-κB表達(dá)陽性的NSCLC標(biāo)本中有30例TLR4表達(dá)陽性。TLR4與NF-κB的相關(guān)系數(shù)r=0.486，提示NSCLC組織中TLR4與NF-κB蛋白表達(dá)密切相關(guān)，見表3。

表3 NSCLC組織中TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)相關(guān)性分析

3 討 論

Medzhitov等[4]于1997年首次證明人類細(xì)胞表面存在TLR蛋白。目前,TLR4廣泛存在于人類細(xì)胞表面，且在多種免疫細(xì)胞表面表達(dá)。有證明[5]研究，TLR4蛋白在多種腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)。病原體的某些特異性成分與周圍分布的炎癥細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等)表面特異性模式識別受體相結(jié)合而發(fā)揮作用，即所謂的病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)，通過產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，可分泌炎癥因子，引起微環(huán)境改變，從而促使腫瘤發(fā)生和發(fā)展。

研究[6-8]發(fā)現(xiàn),TLR4誘導(dǎo)的信號通路在腫瘤形成過程中具有重要作用，并與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Inoue等[9]研究證實(shí)，機(jī)體在受到外來細(xì)菌或病毒感染時，TLRs開啟NF-κB信號通路，促使細(xì)胞因子產(chǎn)生，組建成腫瘤生長所需要的微環(huán)境，進(jìn)一步促使腫瘤啟動、繁殖。Chen等[10]也證明，TLR4作為一個信號通路啟動子，能激活NF-κB，刺激產(chǎn)生促炎癥反應(yīng)環(huán)境的形成，從而導(dǎo)致腫瘤生長和對化療藥物的耐藥性。Takahashi等[11]證實(shí)，因長期肺組織損傷而誘發(fā)的炎癥可促進(jìn)肺癌的發(fā)生，提示應(yīng)用抗感染治療可預(yù)防或減緩肺癌的發(fā)病進(jìn)程?？梢?，與炎癥相關(guān)的肺癌可能發(fā)病機(jī)制之一為腫瘤微環(huán)境中炎癥免疫被削弱和腫瘤免疫逃逸[12-13]。Fu等研究[14]發(fā)現(xiàn)，NSCLC中TLR4表達(dá)明顯升高，與正常肺組織相比，TLR4表達(dá)與腫瘤分化程度密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,TLR4和NF-κB在NSCLC組織中的陽性表達(dá)率分別為60.3%和67.2%,顯著高于癌旁正常肺組織(15.5%和8.6%),提示NSCLC組織中通過TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的異常表達(dá)而引起NF-κB表達(dá)增高，可能在NSCLC腫瘤逃逸和進(jìn)展中發(fā)揮作用。此外，在NSCLC低、中、高分化組織中TLR4蛋白陽性表達(dá)率分別為83.3%、67.7%和26.7%,兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示TLR4蛋白表達(dá)越高，NSCLC分化程度越低，TLR4表達(dá)增強(qiáng)者，癌組織分化程度越差，惡性程度越高，這與何鳳蓮等[15]結(jié)果一致。

Bltimore于1986年發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，其存在于細(xì)胞核內(nèi)。研究[16]表明，被活化的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，而其充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子的作用是通過含κB序列結(jié)合位點(diǎn)且與多種基因啟動子區(qū)結(jié)合而發(fā)揮作用，多種決定細(xì)胞分化或凋亡的細(xì)胞因子被活化并發(fā)生基因轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控細(xì)胞生長，調(diào)節(jié)多種黏附、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄而參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，NSCLC組織中TLR4蛋白表達(dá)與NF-κB蛋白表達(dá)密切相關(guān)，說明通過TLR4激活NF-κB信號通路機(jī)制可能在NSCLC的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。此外，NF-κB在腺癌中的表達(dá)明顯高于鱗癌，提示NF-κB表達(dá)的高低對判定腫瘤的病理類型具有一定價值。

總之,NSCLC組織中TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)異常增高，明顯上調(diào)，且兩者表達(dá)具有明顯相關(guān)性，提示通過TLR4/NF-κB信號通路可能誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生，從而使肺癌細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增長。

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