VEGF及DLL4在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

楊 軍,王連新,季 驪,周 健,倪立新

(江蘇省啟東市人民醫(yī)院 啟東肝癌研究所,江蘇 啟東,226200)

肝細(xì)胞癌(HCC)在全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率分別占惡性腫瘤發(fā)病和死亡的第5位和第3位[1],在中國(guó)是惡性腫瘤的第2位死因[2],是臨床常見的惡性腫瘤之一，其手術(shù)后的高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率是HCC患者死亡率居高不下的最主要原因[3]。HCC的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有賴于腫瘤新生血管的生長(zhǎng)以供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)[4]。目前，對(duì)肝細(xì)胞肝癌中血管生發(fā)的研究及作用機(jī)制的探索已成為一個(gè)熱點(diǎn)[5]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在腫瘤的生長(zhǎng)、播散及轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著著極為重要的作用，可誘導(dǎo)腫瘤血管分化及形成，是參與血管生發(fā)和成熟的最重要的條件之一[6]。Delta-Notch信號(hào)通路尤其是其配體DLL4(Delta樣配體4)被認(rèn)為是調(diào)節(jié)腫瘤血管生發(fā)和成熟的另一個(gè)重要條件，使腫瘤血管的功能和結(jié)構(gòu)得以優(yōu)化，更有利于為腫瘤組織運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且DLL4與VEFG相互影響形成反饋?zhàn)饔?。本研究測(cè)定肝細(xì)胞肝癌組織中VEGF和DLL4的表達(dá)量，分析與肝細(xì)胞肝癌臨床病理分期的關(guān)系及其臨床意義，擬為肝細(xì)胞肝癌的抗血管生成靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病理及組織標(biāo)本

收集啟東市人民醫(yī)院、啟東肝癌研究所外科2010年1月— 2013年6月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的肝細(xì)胞肝癌組織石蠟標(biāo)本75例，全部病例術(shù)前均未接受肝動(dòng)脈介入栓塞等治療。其中男46例，女29例，年齡35～72歲，中位年齡53歲,<60歲48例,≥60歲27例。

1.2 主要試劑及方法

兔抗人DLL4 多克隆抗體(Abcam公司)、兔抗人VEGF單克隆抗體(北京中杉金橋生物有限公司)、SP免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物有限公司)。染色步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。用磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作為空白對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

所有的標(biāo)本均通過(guò)2位病理醫(yī)師進(jìn)行評(píng)判。VEGF、DLL4以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色。根據(jù)染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分。隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)目<5%為(-),5%～25%為(+),25%～50%為(2+)，50%～75%為(3+)，>75%為(4+)。(2+)及以上為陽(yáng)性表達(dá)，用以計(jì)算陽(yáng)性率。

1.4 統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用χ2檢驗(yàn)分析VEGF和DLL4在各臨床病理數(shù)據(jù)中的表達(dá)情況。VEGF與DLL4表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 VEGF、DLL4在肝細(xì)胞癌及癌旁組織中的表達(dá)

75例肝細(xì)胞癌標(biāo)本中，VEGF陽(yáng)性顆粒主要定位于腫瘤細(xì)胞質(zhì),DLL4陽(yáng)性顆粒主要定位于腫瘤細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，二者顆粒均呈棕黃色。在肝細(xì)胞肝癌組織中VEGF蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為 64.0%(48/75),顯著高于對(duì)照組的13.3%(4/30),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。DLL4蛋白在肝細(xì)胞肝癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為81.3%(61/75),顯著高于對(duì)照組的23.3%(7/30),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1、圖2、表1。

圖1 VEGF在肝細(xì)胞肝癌中的陽(yáng)性表達(dá) (SP 400倍)

圖2 DLL4在肝細(xì)胞肝癌中的陽(yáng)性表達(dá) (SP 400倍)

2.2 VEGF及DLL4在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的差異

VEGF及DLL4蛋白在肝細(xì)胞肝癌中表達(dá)與腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目(P<0.05)、脈管浸潤(rùn)(P<0.01)有關(guān)，各臨床病理參數(shù)分組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 而與患者的性別、年齡、腫瘤大小、是否肝硬化、有無(wú)腫瘤包膜、腫瘤分化程度無(wú)關(guān)，各臨床病理參數(shù)分組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 VEGF和DLL4在肝細(xì)胞肝癌及癌旁肝組織中的表達(dá)情況[n(%)]

2.3 在肝細(xì)胞肝癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

VEGF和DLL4的表達(dá)具有顯著一致性，在VEGF陽(yáng)性表達(dá)標(biāo)本中的DLL4表達(dá)率明顯高于VEGF陰性表達(dá)的標(biāo)本,VEGF和DLL4在肝細(xì)胞肝癌組織中陽(yáng)性表達(dá)水平呈明顯正相關(guān)(r=0.217,P<0.05)。見表3。

表2 VEGF和DLL4的表達(dá)與各腫瘤臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系[n(%)]

表3 肝細(xì)胞肝癌中VEGF和DLL4表達(dá)的相關(guān)性

3 討 論

肝細(xì)胞肝癌是死亡率較高的惡性腫瘤之一，其生長(zhǎng)與血管生成密切關(guān)系，豐富的腫瘤血管為其生長(zhǎng)提供充分的營(yíng)養(yǎng)支持，為浸潤(rùn)播散及轉(zhuǎn)移提供了營(yíng)養(yǎng)保障。其中VEGF和DLL4-Notch信號(hào)通路相互作用，共同調(diào)控腫瘤血管生成，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。

VEGF是一種在細(xì)胞內(nèi)合成的肝素結(jié)合糖蛋白，與細(xì)胞膜上硫酸類肝素蛋白多糖結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，經(jīng)過(guò)蛋白水解作用后以二聚體形式分泌到細(xì)胞外，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管，包括腫瘤血管的形成及生長(zhǎng)[7]。在腫瘤的生長(zhǎng)及發(fā)展過(guò)程中，VEGF起著極為重要的作用，可促進(jìn)腫瘤血管形成來(lái)輸送各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及氧氣，以滿足腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)需要，在腫瘤組織中有較高表達(dá)[6]。VEGF作用于內(nèi)皮細(xì)胞上的特異性受體，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成。另外VEGF還有利于腫瘤細(xì)胞脫落進(jìn)入血循環(huán)或向臨近組織擴(kuò)散，有利于腫瘤的浸潤(rùn)生長(zhǎng)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果證實(shí)：VEGF蛋白在肝細(xì)胞肝癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常肝細(xì)胞肝組織(P<0.01),提示VEGF的異常高表達(dá)促進(jìn)了肝細(xì)胞肝癌中的血管生發(fā)，而在正常肝細(xì)胞肝組織的VEGF的表達(dá)水平并不能起促血管生發(fā)作用。同時(shí)，本研究證實(shí)VEGF蛋白的表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌腫瘤的結(jié)節(jié)數(shù)目(P<0.05)、脈管是否浸潤(rùn)(P<0.01)有關(guān)，說(shuō)明VEGF促進(jìn)了肝細(xì)胞肝癌的浸潤(rùn)與播散。

Notch信號(hào)通路是公認(rèn)的控制血管發(fā)育和病理血管形成的關(guān)鍵信號(hào)通路[8],而DLL4(Delta樣配體4)是Notch受體的重要配體之一，其特異性表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞而引起關(guān)注。近年來(lái)有研究[9]表明,DLL4在膀胱癌細(xì)胞中高表達(dá)，在侵襲性膀胱癌中DLL4表達(dá)升高尤為顯著。隨后體外實(shí)驗(yàn)表明,DLL4不但調(diào)控胚胎血管的生成，還調(diào)控腫瘤血管的生長(zhǎng)，而且影響腫瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展[10]。DLL4起初在胚胎發(fā)育時(shí)的動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，隨后研究發(fā)現(xiàn),DLL4在血管前方的內(nèi)皮尖端細(xì)胞主要表達(dá)于細(xì)胞膜[11]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)在肝細(xì)胞肝癌組織中DLL4蛋白的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(P<0.01),提示DLL4可能參與肝細(xì)胞肝癌的病程進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)還證實(shí),DLL4蛋白的表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌的結(jié)節(jié)數(shù)目(P<0.05)、脈管是否浸潤(rùn)(P<0.01)有關(guān)，說(shuō)明DLL4高表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌的侵襲。

VEGF與DLL4關(guān)系密切,DLL4-Notch信號(hào)通路受VEGF的調(diào)控，而DLL4對(duì)VEGF又具有反作用。Ridgway等[12]在一項(xiàng)裸鼠負(fù)瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)Notch/DLL4信號(hào)通路與VEGF之間存在“串話”(cross talk),阻斷DLL4-Notch受體通路能導(dǎo)致大量無(wú)功能新生血管形成，這種阻斷對(duì)存在耐受VEGF拮抗藥的個(gè)體同樣有效。Williams等[13]在血管內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，VEGF可誘導(dǎo)尖端細(xì)胞表達(dá)DLL4,由此假設(shè)DLL4是VEGF的下游基因，與其一起作用調(diào)控萌發(fā)和分支的形態(tài)。DLL4與VEGF之間有一個(gè)負(fù)反饋?zhàn)饔?，即VEGF上調(diào)DLL4的表達(dá)，而DLL4可能由其他途徑壓制血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)VEGF刺激的反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn),VEGF和DLL4蛋白的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.217,P<0.05),說(shuō)明VEGF與DLL4共同參與肝細(xì)胞肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

目前肝細(xì)胞癌的血管靶向藥物已應(yīng)用于臨床，貝伐單抗(Bevacizumab,Avastin)與VEGF單克隆IgG1抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，選擇性地抑制VEGF,抑制新生血管形成。索拉非尼(Sorafenib,多吉美)通過(guò)靶向阻斷Ras-Raf-MAPK通路上的Raf激酶，直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖，同時(shí)還可抑制VEGFR-2、VEGFR-3、c-Kit等多種受體，以抑制腫瘤血管生成，起到抗血管生成和抗腫瘤細(xì)胞增殖的雙重作用[14],在肝癌的晚期或輔助治療中起了一定的作用。但由于部分HCC患者存在對(duì)該藥的耐受，治療效果不甚理想[15-16]。

迄今為止,HCC患者中DLL4與VEGF兩者表達(dá)及相互關(guān)系的臨床與實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道不多。本實(shí)驗(yàn)對(duì)肝細(xì)胞肝癌組織中VEGF和DLL4蛋白水平進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者在肝細(xì)胞肝癌中表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，提示兩者在肝細(xì)胞肝癌的生長(zhǎng)與擴(kuò)散中起著協(xié)同作用。DLL4-Notch信號(hào)通路有望在VEGF之后成為肝細(xì)胞肝癌抗血管靶向治療的又一個(gè)新靶點(diǎn)，聯(lián)合作用于VEGF和DLL4有望增加靶向藥物的療效。

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