江蘇省南京地區(qū)肺炎鏈球菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥及傳播機制

丁晶晶,苗立云,李 燕,蔡后榮

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 呼吸科,江蘇 南京,210008)

肺炎鏈球菌是兒童和成人社區(qū)獲得性肺炎的最重要病原菌，同時也是引起中耳炎、鼻竇炎、腦膜炎的主要病原菌。長期以來，青霉素等-內(nèi)酰胺類抗生素是治療肺炎鏈球菌感染的首選抗生素。但近年來，耐青霉素肺炎鏈球菌逐年增多，亞洲地區(qū)耐藥情況尤為嚴(yán)重，已引起臨床的廣泛關(guān)注。肺炎鏈球菌對-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥機制主要通過青霉素結(jié)合蛋白(PBP)改變而產(chǎn)生，與-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性關(guān)系密切的有pbp1A、pbp2B和pbp2X基因,pbp2B和pbp2X與低水平耐藥相關(guān)，而pbp1A的改變導(dǎo)致高水平耐藥，pbp2B和pbp2X分別是青霉素和頭孢菌素的第一靶位[1-3]。由于肺炎鏈球菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥率逐年增加且存在明顯的地區(qū)差異，而南京地區(qū)尚未有相關(guān)的大型流行病學(xué)調(diào)查，因此本研究探討南京地區(qū)肺炎鏈球菌臨床分離株對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性及耐藥機制，了解其主要突變類型及耐藥傳播方式，為今后快速診斷耐藥株及阻止高耐株的傳播打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑和儀器

optochin紙片(OXOID,UK),Mueller-Hinton培養(yǎng)基(OXOID,UK),哥倫比亞培養(yǎng)基(OXOID,UK),Taq聚合酶(TAKARA,Japan),HinfI 內(nèi)切酶(TAKARA,Japan),VIABANKTM菌種保存盒(MW&E,UK),細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(AXGEN,USA),高速冷凍離心機Z-303K(HERMLE,Germany),PCR擴增儀PTC-100TM(MJ Research Inc,USA),穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 3000Xi (Biorad,USA),捷達(dá)凝膠成像系統(tǒng)(江蘇捷達(dá)科技發(fā)展有限公司)，H.SWX-600BS數(shù)顯電熱恒溫水浴箱(上海新苗醫(yī)療器械公司)，所有PCR引物均由invitrogen公司合成提供。藥品來源：青霉素(山東魯杭)、頭孢呋辛鈉(葛蘭素史克)、頭孢噻肟(蘇州二葉)、頭孢曲松鈉(臺灣泛生)、頭孢吡肟(施貴寶)、阿莫西林(蘇州二葉)、紅霉素(大連美羅大)、阿奇霉素(輝瑞)、左旋氧氟沙星(浙江醫(yī)藥)、莫西沙星(拜耳)、美羅培南(柱友制藥)、萬古霉素(浙江醫(yī)藥)、替加環(huán)素(惠氏制藥)、利奈唑胺(輝瑞制藥)。

1.2 菌株的采集、分離和鑒定

收集2010年3月—2012年6月南京地區(qū)7家醫(yī)院(南京市鼓樓醫(yī)院，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院，南京市兒童醫(yī)院，江蘇省人民醫(yī)院，南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院，南京市第一醫(yī)院)微生物室分離的肺炎鏈球菌菌株共130株，其標(biāo)本來源主要為痰、血、腦脊液、鼻咽拭子、中耳分泌物、眼分泌物、膿汁、氣管抽吸物等。標(biāo)本采集1 h內(nèi)接種于哥倫比亞瓊脂血平板，置5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃孵育，分離出的菌株用optochin紙片和膽汁溶菌試驗鑒定為肺炎鏈球菌，菌株于VIABANKTM菌種保存管中-70 ℃冰凍保存。

1.3 抗生素敏感性檢測

肺炎鏈球菌對抗生素敏感性的檢測采用美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)推薦的瓊脂稀釋法，共有14種抗生素進(jìn)行了最低抑菌濃度(MIC)的測定：青霉素、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢吡肟、阿莫西林、紅霉素、阿奇霉素、左旋氧氟沙星、莫西沙星、美羅培南、萬古霉素、替加環(huán)素、利奈唑胺。采用含5%脫纖維羊血的M-H藥敏培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2條件下孵育18～24 h后觀察結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 49619跟隨全程作為質(zhì)量控制。結(jié)果判定依據(jù)2004年NCCLS標(biāo)準(zhǔn)，替加環(huán)素、利奈唑胺按照FDA2005診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

1.4 β-內(nèi)酰胺類耐藥相關(guān)基因的擴增及測序

肺炎鏈球菌基因組DNA的提取按照Axygen細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說明進(jìn)行，所得產(chǎn)物-20 ℃保存作為PCR反應(yīng)的模板。β-內(nèi)酰胺類耐藥相關(guān)基因pbp1A、pbp2B、pbp2X的擴增引物見表1，擴增體系均為: 25 ng DNA模板,2 mM MgCl2,200 μM dNTP,1.5 U Taq 聚合酶，總反應(yīng)體積為25 μL。pbp 基因的反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性1 min,55℃退火1 min,72 ℃延伸(pbp1A 2.5 min、pbp2B1.5 min、pbp2X 2 min),循環(huán)33次后再延伸7 min。murM基因的反應(yīng)條件為: 94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性40 s,52 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)30次。擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后交由上海Invitrogen公司，采用ABI PRISMTM 3730自動測序分析儀進(jìn)行測序分析，測序結(jié)果通過DNASIS軟件和在線BLAST軟件進(jìn)行比對分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。

1.5 pbp指紋圖譜分型

前面所得到的pbp1A、pbp2B、pbp2X擴增產(chǎn)物，片段長度分別為2.4 kb、1.5 kb、2 kb，取6 μL經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)無非特異性條帶后，進(jìn)行限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性分析(RFLP)，所得圖譜即pbp指紋圖譜[4]可用作菌株同源性比較。取10 μL擴增產(chǎn)物加入1 μL(10 U) HinfI內(nèi)切酶,37 ℃孵育4 h,取消化產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下成像，判斷結(jié)果。

表1 β-內(nèi)酰胺類耐藥相關(guān)基因擴增引物序列

1.6 統(tǒng)計分析

應(yīng)用WHONET 5.0建立藥敏檢測數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行藥敏數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0對率進(jìn)行χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者一般情況

分離到肺炎鏈球菌患者的主要疾病分布為急性支氣管肺炎(n=80,61.5%)、肺炎(n=27,20.8%)、菌血癥(n=7,5.4%)、中耳炎(n=7,5.4%)、上呼吸道感染(n=4,3.1%)、結(jié)膜炎(n=3,2.3%)、腦膜炎(n=2,1.5%)?；颊咧形荒挲g為3歲(1月～88歲),62.3%為男性，在34例成人患者中有27例(79.4%)合并有其他基礎(chǔ)疾?。郝阅I病(20.6%),COPD(17.6%),腫瘤(14.7%),心血管疾病(11.8%),糖尿病(5.9%),腦血管疾病(2.9%),除腎臟病外其他激素服用者(5.9%)。

表2 130株肺炎鏈球菌對14種常用抗生素的敏感性檢測

2.2 藥敏結(jié)果及聯(lián)合耐藥情況

肺炎鏈球菌對14種常用抗生素的敏感性檢測結(jié)果見表2表明，南京地區(qū)臨床分離的肺炎鏈球菌青霉素不敏感率為74.6%,其中23.1%中介,51.5%耐藥，MIC50和MIC90分別為2 μg/mL、4 μg/mL。在檢測的4種頭孢菌素中，頭孢呋辛耐藥率最高，為69.2%,且耐藥水平較高，其MIC50、MIC90分別為2 μg/mL、4 μg/mL,頭孢噻肟、頭孢吡肟的耐藥率也較高，分別為17.7%和12.3%。而在β-內(nèi)酰胺類抗生素中，頭孢曲松和阿莫西林有相對較好的敏感性，其耐藥率分別為3.1%、6.2%。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素如紅霉素、阿齊霉素均有很高的耐藥率(92.3%、90.8%)，且絕大多數(shù)菌株耐藥水平≥256 μg/mL。本地區(qū)肺炎鏈球菌對喹諾酮類藥物的敏感性較好。所有130株臨床分離株對左氧氟沙星、莫西沙星、萬古霉素、替加環(huán)素、利奈唑胺均敏感。然而，美羅培南的敏感性并不理想，中介率為7.7%,耐藥率為16.9%。由于該研究中肺炎鏈球菌主要分離自兒童，將患者分成兒童組和成人組后發(fā)現(xiàn)，兒童分離株青霉素耐藥率為65.6%,而成人分離株青霉素耐藥率僅為11.8%,且兒童組MIC水平普遍高于成人組。作者將患者細(xì)分為4組(表3)：學(xué)齡前兒童(0～3歲)、學(xué)齡兒童(4～14歲)、中青年(15～64歲)、老年(65～88歲)，利用χ2檢驗比較各組耐藥率、不敏感率的差異，學(xué)齡前兒童和學(xué)齡兒童、中青年和老年，其青霉素耐藥率、不敏感率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。通過青霉素與其他β-內(nèi)酰胺類抗生素MIC水平的相關(guān)性比較發(fā)現(xiàn)，在青霉素耐藥株中，頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢吡肟、阿莫西林和美羅培南的耐藥率及耐藥水平均顯著高于青霉素敏感株。通過Spearman秩相關(guān)分析，青霉素與其他β-內(nèi)酰胺類抗生素MIC水平呈正相關(guān)(0

表3 青霉素敏感性與患者年齡的關(guān)系

2.3 分子生物學(xué)分型

對3組pbp基因進(jìn)行限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性分析(RFLP),所得圖譜作為肺炎鏈球菌pbp指紋圖譜用于分析其同源性(圖1)。本研究中pbp1A共得到5種譜型: A1～A5; pbp2B共得到7種譜型: B1～B7; pbp2X共得到10種譜型: X1～X10。在青霉素敏感株中，最常見的pbp1A譜型為A3，pbp2B中最常見的為B3型，而pbp2X中沒有與青霉素敏感株密切相關(guān)的譜型，但與頭孢曲松敏感株關(guān)系密切的是X5型。結(jié)合pbp指紋圖譜，在β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥株中，最常見的耐藥型為A1-B1-X1，共有25株。在8株阿莫西林耐藥株中，有5株為A1-B1-X1型，且阿莫西林、青霉素、頭孢曲松的MIC分別為8 μg/mL、4 μg/mL、4 μg/mL，這5株均來自兒童醫(yī)院，分離時間間隔不超過15 d,可能為同一多耐藥克隆株。其余阿莫西林高耐株的分子表型為A1-B2-X7、A2-B1-X6、A1-B5-X9。

(M,100bp marker; A1～A5: pbp1A; B1～B7: pbp 2B; X1～X10: pbp2X)

3 討 論

目前肺炎鏈球菌青霉素耐藥較嚴(yán)重地區(qū)有[5-8]: ① 亞洲(韓國、日本、越南、泰國); ② 歐洲西部和南部(西班牙、法國、葡萄牙); ③ 歐洲中東部地區(qū)(匈牙利、羅馬尼亞、比利時、土耳其); ④ 俄羅斯西北部; ⑤ 南非; ⑥ 巴布新幾內(nèi)亞; ⑦ 美國的阿拉斯加; ⑧ 美國東南部; ⑨ 南美。中國的肺炎鏈球菌青霉素耐藥率也呈逐年上升趨勢。劉又寧等[9]對國內(nèi)7個城市12個中心的665例成人社區(qū)獲得性肺炎患者進(jìn)行調(diào)查，其中肺炎鏈球菌檢出率為10.3%，青霉素中介株(PISP)占17.4%,耐藥株(PRSP)占2.9%。王輝等[10]搜集2002—2003年共410株肺炎鏈球菌，PISP為23.9%,杭州最高占44.1%; PRSP平均占22.7%,上海最高占31.9%。本調(diào)查結(jié)果顯示，南京地區(qū)臨床分離株青霉素不敏感率為74.6%,顯著高于其他城市，且其他β-內(nèi)酰胺類抗生素如頭孢呋辛、頭孢噻肟的敏感率也并不理想，可能與此類抗生素的使用不當(dāng)導(dǎo)致耐藥株的篩選和傳播有關(guān)。而該人群中使用頭孢吡肟、美羅培南的患者并不多，但這2種抗生素也存在一定的耐藥率，可能是由于藥物結(jié)構(gòu)相似導(dǎo)致了交叉耐藥的出現(xiàn)。本地區(qū)的高耐藥性可能與標(biāo)本主要來自兒童有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，從兒童分離的肺炎鏈球菌，其耐藥率及耐藥水平均明顯高于成人，而以往報道的耐藥相關(guān)危險因素[11]包括在日托中心或幼兒園等人口密集處、有基礎(chǔ)疾病或入住康復(fù)中心的老年患者等。因此我們把患者分為學(xué)齡前兒童、學(xué)齡兒童、中青年、老年，但學(xué)齡前兒童與學(xué)齡兒童的耐藥率并無顯著差異，說明本地區(qū)兒童耐藥率主要與用藥習(xí)慣有關(guān)，而沒有出現(xiàn)明顯的幼兒園或?qū)W校內(nèi)傳播，中青年與老年的耐藥率也無顯著差異。Ronald等[12]在一項大樣本多中心的研究中分析了年齡與肺炎鏈球菌耐藥型的關(guān)系，結(jié)果表明：在≥65歲的人群中，對喹諾酮類抗生素的耐藥率為4.9%,顯著高于其他年齡組。

本研究中應(yīng)用了pbp指紋圖譜對肺炎鏈球菌菌株進(jìn)行分型比較，發(fā)現(xiàn)大部分耐藥株在基因組水平上無明顯同源性，其耐藥性主要通過點突變的累積和基因重組而獲得，但有5株阿莫西林耐藥株高度同源，可能為院內(nèi)克隆傳播。與點突變的累積效應(yīng)類似，肺炎鏈球菌的重組突變是一個逐步完成的過程，通過多次基因重組，抗生素對該克隆的MIC超過一定折點值，便形成了耐藥株。耐藥克隆在地區(qū)間的播散更是全球PRSP流行的重要基礎(chǔ)，ANSORP來自亞洲11個國家14家研究中心的數(shù)據(jù)顯示，西班牙23F和臺灣19F耐藥克隆株在亞洲地區(qū)的多個國家存在，說明全球流行的耐藥克隆株也在亞洲地區(qū)國家進(jìn)行廣泛的傳播和繁殖[13]。目前，本地區(qū)尚未出現(xiàn)大規(guī)模耐藥克隆株的傳播，但有待進(jìn)一步進(jìn)行分子流行病學(xué)監(jiān)測。

抗生素耐藥菌株的傳播和新疫苗的開發(fā)都需要肺炎鏈球菌的分子流行病學(xué)研究，分子生物學(xué)分型能提高分辨水平并提供整個基因組更詳細(xì)的信息，在追查耐藥菌株傳播方面起著不可替代的作用。本研究中應(yīng)用的pbp指紋圖譜操作簡單，對儀器要求不高，能夠應(yīng)用于普通臨床微生物室的流行病學(xué)監(jiān)測。除此之外，常用的肺炎鏈球菌分子分型方法還有脈沖場凝膠電泳[14](PFGE)和多位點序列分型[15-17](MLST),其中最為精確的是MLST，該法是通過7種看守基因的內(nèi)部片段序列進(jìn)行鑒別比較的，其優(yōu)點在于查詢方便，標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一，分辨水平很高，有利于世界范圍內(nèi)肺炎鏈球菌的檢測和流行病學(xué)調(diào)查。

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