BQ123對(duì)大鼠肢體缺血再灌注后骨骼肌的保護(hù)機(jī)制

劉燕 彭海兵 王建輝 王銀環(huán) 楊秀紅 張連元

·論著·

BQ123對(duì)大鼠肢體缺血再灌注后骨骼肌的保護(hù)機(jī)制

劉燕 彭海兵 王建輝 王銀環(huán) 楊秀紅 張連元

目的探討大鼠肢體缺血再灌注(LIR)后骨骼肌細(xì)胞損傷變化,以及內(nèi)皮素A(ETA)受體拮抗劑BQ123對(duì)其保護(hù)效應(yīng)的機(jī)制。方法雄性Wistar 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(雙后肢松弛環(huán)繞橡皮圈，不阻斷血流)，LIR組(結(jié)扎大鼠雙后肢根部4 h，恢復(fù)血流灌注4 h)和BQ123處理組(松帶前15 min給予BQ123 7μg/kg，其他操作同LIR組)，每組8只。檢測(cè)肢體缺血4 h再灌注4 h后各組骨骼肌組織中一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素(ET-1)以及NO/ET-1、活性氧(ROS)、髓過(guò)氧化物酶(MPO)、Ca2+、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶；采用原位脫氧核糖核甘酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL) 檢測(cè)各組腓腸肌細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果LIR組與對(duì)照組相比較，骨骼肌組織NO、ET-1、ROS、 MPO和Ca2+含量均增加，NO/ET-1比值減小，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性降低，凋亡指數(shù)(AI)明顯增高(P<0.01)；與LIR組比較，BQ123組骨骼肌組織NO含量升高，ET-1、ROS、MPO和Ca2+含量下降，NO/ET-1比值升高，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性升高，AI下降(P<0.01)。結(jié)論BQ123 對(duì)大鼠LIR后骨骼肌的保護(hù)作用與其拮抗ET-1的作用，改善微循環(huán)、減輕氧化損傷、細(xì)胞內(nèi)鈣超載有關(guān)。

再灌注損傷；骨骼肌；內(nèi)皮縮血管肽1

肢體缺血再灌注(limb ischemia reperfusion，LIR)見(jiàn)于交通事故造成的肢體擠壓傷、骨筋膜室綜合征、斷肢再植等。LIR這一常見(jiàn)病理過(guò)程不容忽視，其在引起缺血肢體損傷的同時(shí)，可進(jìn)一步導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)和多器官功能障礙[1,2]。由于骨骼肌微血管結(jié)構(gòu)和功能完整是實(shí)現(xiàn)骨骼肌再灌注的前提，因此，保護(hù)好微血管內(nèi)皮的結(jié)構(gòu)和功能是防治骨骼肌無(wú)復(fù)流和再灌注損傷的關(guān)鍵措施。內(nèi)皮素(endothelin,ET)是血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的一種內(nèi)皮收縮因子，ET-1存在ETA和ETB兩種受體。ETA受體參與多種生物學(xué)事件，如血管收縮和缺血再灌注炎性損傷反應(yīng)[3]。BQ123為選擇性ETA受體阻斷劑,本研究利用在體大鼠缺血-再灌注模型，研究BQ123藥物后適應(yīng)對(duì)LIR后骨骼肌損傷的具體保護(hù)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 10周齡雄性Wistar大鼠24只，體重200～250 g，由河南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；NO、ROS、MPO、Ca2+、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶試劑盒購(gòu)于南京建成生物制品公司；ET-1試劑盒購(gòu)于解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免所；TUNEL試劑盒購(gòu)于北京中山生物試劑公司；BO123購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。Axiovert 200蔡司光學(xué)儀器購(gòu)于上海,美國(guó)產(chǎn)SIGMA-2M/ETM低溫高速離心機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備與分組:大鼠術(shù)前 12 h禁食，自由飲水。將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為L(zhǎng)IR組、BQ123處理組和對(duì)照組，每組8只。LIR組：采用止血帶法制作大鼠LIR模型，用橡皮圈環(huán)繞結(jié)扎大鼠雙后肢根部，并經(jīng)激光多普勒血流儀監(jiān)測(cè)并證實(shí)血流被阻斷,4 h 后松解橡皮帶恢復(fù)血流灌注,再經(jīng)過(guò)4 h 后放血處死動(dòng)物。動(dòng)物于松解肢體前30 min稱重、麻醉，頸部正中切開(kāi)皮膚，鈍性分離左側(cè)頸靜脈并行靜脈插管。BQ123處理組：操作同LIR組,松帶前15 min經(jīng)頸靜脈滴注BQ123(7 μg/kg)。LIR組和對(duì)照組均于松帶前15 min經(jīng)頸靜脈滴注0.9%氯化鈉溶液(4 ml/kg)。

1.2.2 骨骼肌組織NO、ET-1、ROS、MPO、Ca2+、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶含量：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)經(jīng)腹主動(dòng)脈放血致死動(dòng)物后即刻取雙側(cè)腓腸肌組織,液氮速凍，-70℃儲(chǔ)藏備用。用扭力天平稱取凍存的骨骼肌組織200 mg，移入裝有2 ml冷0.9%氯化鈉溶液的勻漿管中，冰浴條件下制備骨骼肌組織勻漿。收集上清液采用放免法測(cè)定3組ET-1含量，采用生物化學(xué)法測(cè)定組織NO、ROS、MPO、Ca2+、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶含量。

1.2.3 骨骼肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)：每組隨機(jī)腓腸肌放入10 ml/L中性甲醛固定、包埋、切片。采用TUNEL法測(cè)定骨骼肌細(xì)胞凋亡。采用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)軟件對(duì)腓腸肌組織切片進(jìn)行分析，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別選取相應(yīng)切片，高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)1 000個(gè)骨骼肌細(xì)胞核，平均100個(gè)細(xì)胞核中呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)數(shù)目為AI。

2 結(jié)果

2.1 骨骼肌組織NO、ET-1、NO/ET-1、ROS和 MPO含量變化 LIR組與對(duì)照組比較，骨骼肌組織中NO、ET-1、ROS、MPO均明顯升高，NO/ET-1比值下降(P<0.01)；BQ123組與LIR組比較，ET-1、ROS、MPO明顯降低，但仍高于Control組，NO、升高，NO/ET-1比值升高(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 3組骨骼肌組織NO、ET-1、NO/ET-1、ROS和MPO變化

組別NO(μmol/L)ET-1(ng/L)NO/ET-1ROS(U/mgprot)MPO(活力單位/克濕片)對(duì)照組8.00±1.8326.91±4.810.36±0.02108.20±4.230.51±0.10LIR組11.24±2.13*73.77±8.99*0.17±0.01*158.47±16.12*1.66±0.28*BQ123組13.59±2.07*#43.22±2.59*#0.30±0.03*#126.76±10.40*#1.10±0.19*#

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與LIR組比較，#P<0.01

2.2 3組骨骼肌組織Ca2+、Na+-K+-ATP酶 、Ca2+-ATP酶和凋亡的改變 LIR組與對(duì)照組比較，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶含量均明顯降低，Ca2+升高,AI明顯升高(P<0.01)；BQ123組與LIR組比較，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶升高，而Ca2+降低,AI明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 3組骨骼肌組織Ca2+、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和AI變化

組別Ca2+(mmol/gprot)Na+-K+-ATP酶(umolPi/mgprot/hour)Ca2+-ATP酶(μmolPi/mgprot/h)AI對(duì)照組0.04±0.011.95±0.282.28±0.342.65±0.37LIR組0.14±0.04*0.84±0.10*1.06±0.16*20.08±2.15*BQ123組0.09±0.02*#1.35±0.25*#1.74±0.32*#14.10±2.30*#

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與LIR組比較，#P<0.01

2.3 骨骼肌組織凋亡情況 TUNEL染色可見(jiàn)陽(yáng)性的細(xì)胞核呈棕黃色，形狀不規(guī)整，大小不一致。而正常細(xì)胞的細(xì)胞核被蘇木素復(fù)染呈藍(lán)色。見(jiàn)圖1。

3 討論

圖1 3組骨骼肌組織(TUNEL×400)

Na+-K+-ATP 酶和Ca2+-ATP 酶存在細(xì)胞膜上，是維持細(xì)胞功能正常和離子內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的基礎(chǔ)。與對(duì)照組比較，LIR組骨骼肌組織ATP酶的活性均下降，提示骨骼肌細(xì)胞膜受到了損傷。同時(shí)，骨骼肌細(xì)胞凋亡增加。說(shuō)明缺血4 h再灌注4 h，骨骼肌組織損傷加重。在LIR這一病理過(guò)程中，氧自由基、Ca2+超載、微循環(huán)障礙和酸中毒等都可能是破壞骨骼肌細(xì)胞、降低ATP酶活力和細(xì)胞死亡增加的因素。BQ123是特異性ETA受體阻斷劑，可阻斷ETA受體活性。BQ123組較LIR組ATP酶活性有所提高，骨骼肌細(xì)胞凋亡減少，骨骼肌損傷減輕。骨骼肌損傷指標(biāo)在兩組之間的差別提示BQl23對(duì)ET-1介導(dǎo)的大鼠LIR有明顯的保護(hù)作用。BQ123幾乎無(wú)抑制 ET-1結(jié)合ETB受體的作用[4]。有文獻(xiàn)記載ETB受體可以清除循環(huán)中的ET[5]。還有報(bào)道認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞的ETB受體激活后可抑制ET分泌，構(gòu)成ET分泌的負(fù)反饋回路[6]。本實(shí)驗(yàn)觀察到BQ123組骨骼肌組織ET-1含量下降，可能與上述兩個(gè)原因有關(guān)。

ET是體內(nèi)一類作用強(qiáng)大的內(nèi)源性血管收縮因子，NO 作為一種血管舒張因子,并參與 ET 的清除。NO/ ET-1比值能說(shuō)明兩種生物活性物質(zhì)對(duì)機(jī)體的作用何種占優(yōu)勢(shì)。趙璞等[7]報(bào)道BQ123可增加內(nèi)皮源性NO產(chǎn)生，最終阻斷ET-1所致的收縮血管平滑肌等作用。本結(jié)果顯示,BQ123組較LIR組，NO生成增加，NO/ ET-1升高，明顯抑制了ET-1收縮血管的作用，減輕血管阻力，在一定程度上增大了骨骼肌血液供應(yīng)。中性粒細(xì)胞(PMN)在肢體局部的炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要角色，PMN通過(guò)“呼吸爆發(fā)”釋放大量的氧自由基。ET-1可以對(duì)PMN發(fā)揮有效的趨化作用，并且這種炎性趨化作用是通過(guò)ETA受體進(jìn)行的。ET-1可能通過(guò)刺激提高PMN表面粘附分子的表達(dá)來(lái)增加PMN的聚集[8]。LIR組MPO 活性的增高，說(shuō)明組織中PMN數(shù)量增加。與對(duì)照組比較，LIR 后 4h，骨骼肌組織中ROS明顯增加，提示機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。有研究表明，一定劑量的BQ123可以有效減少脂多糖誘導(dǎo)自由基生成，提供心肌的抗氧化能力[9]。 BQ123組與LIR組比較，ROS及MPO 活性明顯降低。提示，降低ET-1水平對(duì)PMN的聚集及氧自由基的損傷有抑制作用。ET-1 還可激活質(zhì)膜鈣轉(zhuǎn)運(yùn),刺激肌漿網(wǎng)鈣釋放和細(xì)胞內(nèi)鈣離子通道,增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子的釋放[10]。可見(jiàn)，肢體缺血再灌注后，ET-1過(guò)度生成可促進(jìn)Ca2+超載的發(fā)生。LIR后4 h，骨骼肌組織中Ca2+明顯增多。應(yīng)用BQ123后，明顯降低了骨骼肌組織Ca2+含量，這也是其對(duì)LIR后骨骼肌的保護(hù)機(jī)制之一。

綜上所述，ETA受體阻斷劑BQ123對(duì)LIR后骨骼肌組織產(chǎn)生保護(hù)作用與其拮抗ET-1的作用，改善微循環(huán)、減輕氧化損傷、細(xì)胞內(nèi)鈣超載有關(guān)。

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ThemechanismoftheprotectiveeffectofBQ123onskeletalmuscleafterischemiareperfusionofhindlimbsofrats

LIUYan*,PENGHaibing,WANGJianhui*,etal.*BasicMedicineCollegeofHebeiUnitedUniversity,Hebei,Tangshan063000,China

ObjectiveTo observe the injury of skeletal muscle after limbs ischemia reperfusion(LIR) in rats and to investigate the protective mechanism of endothelin-A receptor antagonist BQ123 on the skeletal muscle after LIR.MethodsThe male Wistar rats were randomly divided into three groups,with 8 rats in each group：control group(rubber band around the hind limbs relaxed,without blocking blood flow),LIR group(subjected to 4h of hind limb ischemia and 4h reperfusion),BQ123 treatment group(pretreated with BQ123 7μg/kg 15 minutes before reperfusion).The contents of initric oxide(NO),endothelin-1(ET-1),NO/ET-1,reactive oxygen species(ROS),myeloperoxide(MPO),Ca2+,Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase in skeletal muscle were detected.Apoptosis condition was examined by means of TdT-mediated dUTP nick end labeling(TUNEL).ResultsAs compared with those in control group,the contents of NO,ET-1,ROS,MPO and Ca2+in skeletal muscle tissue were significantly increased in LIR group,however,the levels of NO/ET-1,activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase were decreased,and apoptosis index(AI) was significantly increased(P<0.01).As compared with those in LIR group,the contents of NO were increased,the levels of ET-1,ROS,MPO and Ca2+in skeletal muscle tissue were decreased,the ratio of NO/ET-1 and the activities of Na+-K+-ATPase,Ca2+-ATPase were obviously increased,but AI was significantly decreased in BQ123 treatment group(P<0.01).ConclusionThe protective effect of BQ123 on skeletal muscle of rats after LIR may be related with its effects of antagonizing ET-1,improving microcirculation,alleviating oxidative damage and the calcium overload in cells.

reperfusion injury; skeletal muscle;endothelin-1

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.11.006

項(xiàng)目來(lái)源：河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：12277793) 唐山市科技局科研基金資助課題(編號(hào)：12140209A-27)

063000 河北省唐山市，河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(劉燕、王建輝、王銀環(huán)、楊秀紅、張連元)；河北聯(lián)合大學(xué)冀唐學(xué)院(彭海兵)

R 363

A

1002-7386(2014)11-1620-03

2013-12-22)