Siah2調(diào)控脯氨酰羥化酶3表達在非小細胞肺癌中的臨床意義

潘坤 李鵬 張澤明 趙學(xué)琴 馮欣

·論著·

Siah2調(diào)控脯氨酰羥化酶3表達在非小細胞肺癌中的臨床意義

潘坤 李鵬 張澤明 趙學(xué)琴 馮欣

目的觀察Siah2(seven in absentia2)及脯氨酰羥化酶3(prolyl hydroxylase 3，PHD3)在人非小細胞肺癌及癌旁組織中的表達，并探討上述兩者差異表達在非小細胞肺癌發(fā)病過程中的臨床意義。方法應(yīng)用RT-PCR檢測非小細胞肺癌患者89例腫瘤及癌旁正常肺組織標本Siah2、PHD3 mRNA表達情況，Western blot檢測上述指標的蛋白質(zhì)表達水平，并分析其與肺癌臨床特征的關(guān)系。結(jié)果非小細胞肺癌患者腫瘤組織中Siah2蛋白及mRNA表達量均明顯高于癌旁組織(P<0.05)，PHD3蛋白的表達在腫瘤組織中低于癌旁組織(P<0.05)， PHD3 mRNA在腫瘤組織中的表達高于癌旁組織，Siah2蛋白與PHD3蛋白表達呈負相關(guān)(r=-0.735，P<0.05)，Siah2 蛋白與Siah2 mRNA表達呈正相關(guān)(r=0.821，P<0.05)。結(jié)論Siah2可能通過調(diào)控PHD3表達水平在非小細胞肺癌發(fā)病中發(fā)揮作用。

Siah2；脯氨酰羥化酶；低氧誘導(dǎo)因子-1α；癌，非小細胞肺

實體腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的一個典型特征是腫瘤微環(huán)境的低氧，目前已證實低氧誘導(dǎo)因子1-α(hypoxiα inducible factor 1 αlph， HIF-1α) 大量表達于人體多種腫瘤中，參與了腫瘤的生長繁殖、遠處轉(zhuǎn)移、血管生成、細胞凋亡等[1]，HIF-1α降解的關(guān)鍵是脯氨酰羥化酶(prolyl hydroxylase，PHD)催化HIF-1α脯氨酰殘基羥基化，而催化此過程的羥化酶便是全過程的限速酶[2]，因此，對HIF-1α蛋白表達水平的調(diào)控也就集中到對羥化酶的調(diào)節(jié)水平上來。Siah2是果蠅sina(seven in absentia2) 基因產(chǎn)物的類似物，具有E3泛素連接酶活性，因此可介導(dǎo)HDAC3、MYPT1、TIN2等多種蛋白經(jīng)泛素蛋白酶體途徑降解[3-5]，離體細胞試驗發(fā)現(xiàn)PHD3也是Siah2的作用底物，并且證明Siah2可使PHD3表達水平下降。在非小細胞肺癌的發(fā)展過程中是否也存在同樣的調(diào)控機制尚不明確，本研究選取89例非小細胞肺癌患者腫瘤組織及癌旁正常對照肺組織，應(yīng)用RT-PCR和 Western blot 檢測Siah2、PHD3在腫瘤組織及癌旁組織的表達情況，兩者的表達是否具有相關(guān)性，并進一步探討兩者差異表達在非小細胞肺癌發(fā)病過程中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取河北大學(xué)附屬醫(yī)院2010年7月至2012年4月經(jīng)手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的非小細胞肺癌患者89例的肺癌組織、癌旁正常肺組織(距離腫瘤邊緣>5 cm以上)樣本進行試驗，89例患者中，男54例，女35例；年齡37～64歲，中位年齡58歲。其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組51例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組38例，TNM分期：Ⅰ期26例，Ⅱ期34例，Ⅲ期29例。臨床分期標準：按照第7版美國聯(lián)合癌癥分類委員會(AJCC)和國際抗癌聯(lián)盟(UICC)制訂的TNM分期標準分類。上述患者術(shù)前均未行放療、化療、介入及中醫(yī)中藥等抗腫瘤治療，均有完整的病例資料并全部知情同意。Western blot檢測所用的腫瘤肺組織及癌旁正常肺組織切除后立即置于-70℃冰凍保存。

1.2 實驗方法 RT-PCR：按照上海生工TRIZOL試劑說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄之后行PCR，擴增引物由上海生工合成，PCR 反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，適宜溫度退火30 s，72℃延伸60 s，反應(yīng)適當(dāng)循環(huán)后72℃延伸10 min。得到RT-PCR產(chǎn)物后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)對擴增產(chǎn)物條帶吸光度半定量分析。檢測指標引物序列、退火溫度、產(chǎn)物長度、循環(huán)數(shù)等參數(shù)見表1。

表1 RT-PCR實驗中PHD3、Siah2及內(nèi)參照β-actin的詳細參數(shù)

Western blot：取0.1 g肺組織標本剪碎后加入RIPΑ 裂解液，冰浴勻漿，4℃條件下10 000 g離心，將沉淀去除后上清液即為肺組織總蛋白，將蛋白樣品稀釋至相等濃度后分裝，置于-80℃冰凍保存?zhèn)溆谩嶒灂r應(yīng)用微量進樣器將等量蛋白質(zhì)樣品加至SDS-丙烯酰胺凝膠孔中， 200 V恒壓電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜，封閉液充分漂洗后加入二抗(1∶2 000)室溫雜交1 h，漂洗后化學(xué)發(fā)光法發(fā)光，X線膠片顯影，對擴增產(chǎn)物條帶吸光度行半定量分析。

1.3 結(jié)果評定 上海Tanon Gis-2010圖像分析系統(tǒng)對RT-PCR、Western blot產(chǎn)物條帶行半定量分析，計算目的條帶與內(nèi)參照β-αctin的吸光度比值。

2 結(jié)果

2.1 Siah2 mRNA和蛋白在非小細胞肺癌組織及癌旁對照肺組織中的表達 RT-PCR結(jié)果顯示，Siah2 mRNA在腫瘤組織中的表達高于其配對的癌旁對照肺組織，且其在腫瘤組織及癌旁組織的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)， Western blot結(jié)果顯示Siah2蛋白變化趨勢符合其mRNA的變化趨勢，在腫瘤組織中的表達高于其配對的癌旁對照肺組織(P<0.05)。Siah2的表達在腫瘤不同分期間差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2正常組及不同臨床分期各組間Siah2、PHD3表達差異比較

組別PHD3mRNAPHD3蛋白Siah2mRNASiah2蛋白正常組(n=89)7.1±1.320.7±4.26.4±1.85.5±1.1NSCLCⅠ期(n=26)13.0±2.1*17.2±3.5*12.2±2.2*10.8±1.9*NSCLCⅡ期(n=34)16.5±3.2*#13.8±2.9*#14.7±2.9*#13.4±2.4*#NSCLCⅢ期(n=29)23.4±3.9*#△8.2±1.6*#△19.6±3.1*#△17.4±3.1*#△ F值370.104100.052275.834334.812 P值0.0000.0000.0000.000

注：與正常組比較，*P<0.05；與Ⅰ期組比較，#P<0.05；與Ⅱ期組比較，△P<0.05

2.2 PHD3 mRNA和蛋白在非小細胞肺癌組織及癌旁對照肺組織中的表達 RT-PCR結(jié)果顯示，PHD3 mRNA在腫瘤組織中的表達高于其配對的癌旁對照肺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)， Western blot結(jié)果顯示PHD3蛋白變化趨勢與其mRNA的變化趨勢相反，在腫瘤組織中的表達低于癌旁對照肺組織(P<0.05)，同時PHD3蛋白的表達在腫瘤不同病理分期各組間亦有差異，臨床分期越晚，PHD3蛋白表達越低(P<0.05)。見表2。

2.3 腫瘤組織中Siah2與PHD3表達的相關(guān)性 直線相關(guān)分析表明，在腫瘤組，Siah2蛋白與PHD3蛋白表達呈負相關(guān)(r=-0.735，P<0.05)，Siah2 蛋白與Siah2 mRNA表達呈正相關(guān)(r=0.821，P<0.05)。

3 討論

Siah2蛋白作為一種重要的E3泛素連接酶，可以識別一系列的底物蛋白，使其經(jīng)泛素蛋白酶體途徑降解，進而參與多種組織信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細胞周期調(diào)控、細胞分化、細胞凋亡、腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮重要作用[6]。本實驗發(fā)現(xiàn)，Siah2 mRNA 和蛋白質(zhì)在癌旁對照肺組織中表達較少，腫瘤組織中其表達呈動態(tài)增長變化，且其mRNA 和蛋白質(zhì)表達變化趨勢在腫瘤不同臨床分期各組間相一致，提示Siah2在非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展過程中可能通過自身轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控發(fā)揮作用。國內(nèi)臨床試驗中，已證明Siah2在乳腺癌組織中高表達，并且Siah2的表達水平與腫瘤的臨床病理分期有關(guān)[7]，在肝癌患者中，Siah2亦呈高表達狀態(tài)，并通過Ras—ERK途徑影響腫瘤的生物學(xué)特性[8]，Siah2可能是一個癌基因，在肝癌的發(fā)病過程中發(fā)揮作用[9]。國外有文獻報導(dǎo)，通過應(yīng)用維生素K3抑制Siah2的表達，可抑制黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展[10]，同時還發(fā)現(xiàn)在胰腺癌細胞及肺癌細胞中均有Siah2的高表達，抑制Siah2的表達可顯著抑制人胰腺癌或肺癌裸鼠皮下移植瘤的生長[11,12]。本試驗發(fā)現(xiàn)Siah2在非小細胞肺癌組織中高表達，同國內(nèi)外所得試驗結(jié)果基本一致，上述結(jié)果均提示，Siah2可能是一個癌基因，其表達水平動態(tài)增長可能在非小細胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

本實驗發(fā)現(xiàn)，PHD3的mRNA在腫瘤組織中的表達高于癌旁對照肺組織，Western blot結(jié)果顯示PHD3蛋白變化趨勢與其mRNA的變化趨勢相反。多項研究表明，低氧可以誘導(dǎo)PHD3 mRNA的表達，本實驗中PHD3 mRNA的動態(tài)變化與非小細胞肺癌腫瘤內(nèi)部的低氧環(huán)境是相符的。本實驗還發(fā)現(xiàn)PHD3 mRNA和蛋白的變化趨勢不相符，腫瘤組織中PHD3 mRNA的表達是升高的，而其蛋白的表達水平呈下降趨勢，提示腫瘤組織中PHD3可能存在某種蛋白水平的調(diào)控。研究已發(fā)現(xiàn)多種生物分子可通過不同通路調(diào)控PHD3的表達，并進而影響HIF-1α的穩(wěn)定性，Siah2是最近研究較多的一個熱點。多項研究結(jié)果證實，Siah2具有促進腫瘤發(fā)生和發(fā)展的生物學(xué)功能，其可通過多種通路影響腫瘤生長和侵襲的進程，Siah2/PHD3/HIF-1α通路是其中較為重要的一條通路[13]。國外離體細胞試驗研究發(fā)現(xiàn)，在氧濃度為2%～5%情況下，Siah2可使PHD3經(jīng)蛋白酶體途徑降解，從而降低PHD3水平，減弱PHD3對HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性的抑制[14]。不管在常氧還是在缺氧條件下Siah2在人類293T細胞都可引起PHD3表達水平下降，進而引起與之相對應(yīng)的HIF-1α蓄積。在Siah2被抑制表達的細胞PHD3蛋白穩(wěn)定性明顯增強，HIF-1α及其靶基因表達也明顯減低。研究人員將蛋白酶體降解途徑的抑制劑MG101,MG132等加入Siah2與PHD3的反應(yīng)混合物中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PHD3的降解受到抑制，充分說明了PHD3的降解是通過Siah2介導(dǎo)的蛋白酶體途徑實現(xiàn)的。本實驗發(fā)現(xiàn)Siah2蛋白水平在腫瘤組表達增高，而PHD3蛋白表達水平在腫瘤組呈下降趨勢，Siah2蛋白表達水平與PHD3蛋白表達水平呈負相關(guān)，因此可以推測，在非小細胞肺癌組織中，PHD3蛋白表達水平的下降可能與Siah2的高表達有關(guān)。

綜上所述，Siah2在非小細胞肺癌組織中高表達，其可能通過調(diào)控PHD3的水平進而影響HIF-1α的穩(wěn)定性，進而在非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。闡明Siah2對PHD3的調(diào)控機制對于非小細胞肺癌的臨床診斷和治療具有重要臨床意義。

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Clinicalsignificanceofregulationofprolylhydroxylases3bySiah2innon-smallcelllungcancer

PANKun*,LIPeng,ZHANGZeming*,etal.*DepartmentofRespiratoryMedicine,AffiliatedHospitalofHebeiUniversity,Hebei,Baoding071000,China

ObjectiveTo investigate the expression of Siah2(seven in absentia2) and prolyl hydroxylase 3(PHD3) in non-small cell lung cancer(NSCLC),and to elucidate their clinical significance.MethodsThe mRNA expression levels of Siah2 and PHD3 were detected by RT-PCR in 89 cases of NSCLC and adjacent normal lung tissues,and their protein expression levels were detected by Western Blot.ResultsThe expression levels of Siah2 mRNA and protein in tumor tissues were significantly higher than those in adjacent tissues(P<0.05).The expression levels of PHD3 mRNA in tumor tissues were obviously higher than those in adjacent tissues,however,the expression levels of PHD3 protein in tumor tissues were significantly lower than those in adjacent tissues(P<0.05).The expression of Siah2 protein was negatively correlated to that of PHD3 protein(r=-0.735,P<0.05),however,the expression of Siah2 protein was positively related with that of Siah2 mRNA(r=0.821,P<0.05).ConclusionSiah2 may play a role in pathogenesis of NSCLC by regulating PHD3 expression levels.

Siah2；prolyl hydroxylases; hypoxia inducible factor 1 α;carcinoma,non-small cell lung

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.11.002

071000 河北省保定市，河北大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科(潘坤、張澤明、趙學(xué)琴、馮欣)；中國人民解放軍第252醫(yī)院心血管研究中心(李鵬)

R 734.2

A

1002-7386(2014)11-1608-03

2013-12-11)