肝硬化大鼠中縫背核NOS陽性神經(jīng)元的表達(dá)

朱建忠，劉 冀，王國明，劉建輝，隋月林，石葛明（.滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校解剖學(xué)和組織胚胎學(xué)教研室，河北 滄州 06000；.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所神經(jīng)生物學(xué)研究室，河北 石家莊 05007）

·論著·

肝硬化大鼠中縫背核NOS陽性神經(jīng)元的表達(dá)

朱建忠1，劉 冀1，王國明1，劉建輝1，隋月林1，石葛明2
（1.滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校解剖學(xué)和組織胚胎學(xué)教研室，河北 滄州 061000；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所神經(jīng)生物學(xué)研究室，河北 石家莊 050017）

目的觀察肝硬化大鼠中縫背核一氧化氮合酶（ nitric oxide synthase，NOS）陽性神經(jīng)元的改變，推測其在肝硬化所致肝性腦病發(fā)病中的作用。方法健康雄性Wistar大鼠模型組、對照組各10只，模型組大鼠經(jīng)皮下注射CCl4結(jié)合飲用酒精14周，應(yīng)用NADPH-d免疫組織化學(xué)法觀察中縫背核NOS陽性神經(jīng)元的改變。結(jié)果與對照組相比，模型組大鼠中縫背核NOS陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少、直徑變小、染色強(qiáng)度變淺。結(jié)論肝硬化影響了大鼠中縫背核NOS陽性神經(jīng)元。

肝硬化；中縫核；一氧化氮合酶；大鼠

在肝硬化晚期，常因中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）的功能調(diào)節(jié)紊亂，引起肝性腦病的發(fā)生。肝硬化時的門靜脈高壓，與門靜脈系統(tǒng)血流受阻及內(nèi)臟血流高動力循環(huán)有關(guān)，導(dǎo)致了血液許多活性物質(zhì)的代謝失調(diào)[1]。有研究[2]發(fā)現(xiàn)肝硬化時一氧化氮（nitric oxide，NO）合成增加，暗示NO可能參與了肝性腦病的病理和生理過程，因而受到越來越多的重視。因此，本實驗利用NADPH-d免疫組織化學(xué)的方法觀察肝硬化大鼠中縫背核一氧化氮合酶（ nitric oxide synthase，NOS）陽性神經(jīng)元的形態(tài)及表達(dá)的改變，為肝硬化導(dǎo)致的肝性腦病的研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組：健康雄性Wistar大鼠20只購自河北省實驗動物中心，體質(zhì)量150～200g，隨機(jī)分成2組即模型組（10只）和對照組（10只）。

1.2 肝硬化模型的制備：模型組給予60% CCl4溶液皮下注射結(jié)合5%乙醇自來水溶液飲用。首次每只大鼠0.5mL/100g，以后每只0.3mL/100g，每周注射2次，共14周。

1.3 標(biāo)本制備及染色：所有大鼠經(jīng)10%水合氯醛（600mg/kg）腹腔注射麻醉后，經(jīng)左心室灌注固定，取腦后固定4h（4℃）。而后浸30%蔗糖液（0.1mol/L，pH7.4 PBS配制）中至組織塊沉底，將所需部位行冠狀位冰凍連續(xù)切片，片厚40μm，隔4張取1張，間斷集片于0.1mol/L，pH7．4 PBS中。染色步驟如下，將切片在0.1mol/L PBS漂洗2次后。浸入孵育液（孵育液組成，0.3%Tritonx-100，1g/L NADPH-Ⅱ，0.5g/L NBT）置于37℃ 60～90min，緩沖液終止反應(yīng)，裱片制片。

1.4 數(shù)據(jù)采集：在每只動物的中縫背核處選取5張切片。應(yīng)用IPP6．0圖像分析系統(tǒng)分析對照組和肝硬化組大鼠的NADPH-d陽性神經(jīng)元的神經(jīng)元數(shù)目以及細(xì)胞平均直徑和平均光密度值。

2 結(jié) 果

在對照組大鼠的中縫背核，多數(shù)NOS陽性神經(jīng)元為藍(lán)色深染，NOS陽性神經(jīng)元及纖維散在分布于中縫核各部分，中縫背核較為密集，尤其是中縫背核背側(cè)和腹側(cè)神經(jīng)元數(shù)量較多（圖1A）；與對照組相比，模型組大鼠中縫背核NOS神經(jīng)元染色明顯變淺（圖1B）。與對照組相比，模型組中縫背核NOS陽性神經(jīng)元數(shù)量降低了40.48%（P<0.01），直徑降低了13.67%（P<0.05），光密度值降低了66.67%（P<0.01），見表1。

圖1 NADPH-d染色結(jié)果 （Bar=200μm ×50）

A.對照組;B.模型組

組別數(shù)量（個）直徑（μm）光密度值對照組47．88±6．1712．42±1．890．042±0．010模型組28．50±4．00#10．72±0．41?0．014±0．002#

*P<0.05 #P<0.01與對照組比較（t檢驗）

3 討 論

NO是以左旋精氨酸（L-argininine，L-Arg）為底物，由NOS催化而成。作為一種神經(jīng)遞質(zhì)，NO廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，以自由擴(kuò)散的方式通過細(xì)胞膜并激活鄰近突觸前和突觸后的可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，升高靶細(xì)胞內(nèi)的 cGMP 含量，從而產(chǎn)生一定的生物效應(yīng)。NOS包括神經(jīng)元型、內(nèi)皮源型和誘導(dǎo)型，中樞內(nèi)的NO合成主要受神經(jīng)元型NOS的調(diào)節(jié)，神經(jīng)元型 NOS的活性直接影響通路中NO的合成，其活性越高，NO的合成越多。正常情況下神經(jīng)元型 NOS參與突觸可塑性和神經(jīng)元間的信號傳遞，肝硬化時則表現(xiàn)出神經(jīng)毒性作用[3]。中縫背核位于中腦導(dǎo)水管腹側(cè)，是中腦神經(jīng)元型NOS陽性神經(jīng)元最集中的部位之一[4]。肝功能衰竭時，肝合成蛋白的能力減弱，對體內(nèi)毒物的解毒能力下降，而肝內(nèi)外側(cè)支循環(huán)的建立導(dǎo)致各種毒素繞過肝直接進(jìn)入體循環(huán)，毒物通過血腦屏障進(jìn)入神經(jīng)中樞引發(fā)腦病。有研究[5-7]表明，在肝硬化患者和動物血漿中，NO水平明顯增高，且與疾病的嚴(yán)重性密切相關(guān)。本實驗顯示，肝硬化大鼠中縫背核NOS陽性神經(jīng)元與對照組相比數(shù)量明顯減少、直徑變小、染色強(qiáng)度變淺，推測可能在肝硬化時，由于肝臟解毒功能低下，有毒物質(zhì)進(jìn)入腦內(nèi)損傷了中縫背核NOS神經(jīng)元所致。

綜上所述，肝硬化大鼠中縫背核NOS神經(jīng)元數(shù)量減少、體積減小、光密度值降低，提示中縫背核NOS神經(jīng)元可能參與了肝性腦病的發(fā)生。

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（本文編輯：劉斯靜）

2013-12-30；

2014-01-16

滄州市科技支撐計劃項目（1213141ZD）

朱建忠（1978-），男，河北唐海人，滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校講師，醫(yī)學(xué)碩士，從事人體解剖學(xué)教學(xué)及科研研究。

R572.2

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1007-3205（2014）05-0559-02

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.05.020