肺表面活性物質(zhì)蛋白 B參與新生兒呼吸窘迫綜合征發(fā)病可能機(jī)制的探討

陸 芬 （山東省郯城縣第一人民醫(yī)院新生兒科，山東郯城 276100）

·臨床與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)·

肺表面活性物質(zhì)蛋白 B參與新生兒呼吸窘迫綜合征發(fā)病可能機(jī)制的探討

陸 芬 （山東省郯城縣第一人民醫(yī)院新生兒科，山東郯城 276100）

目的：探討肺表面活性物質(zhì)蛋白 B（SP-B）參與新生兒呼吸窘迫綜合征（RDS）發(fā)病的可能機(jī)制．方法：選取我院2011-09／2013-09收治的63例因 RDS死亡且無(wú)血緣關(guān)系的新生兒為 RDS組，分為32周以下組、32～36周組及36周以上組，每組各21例；選取我院收治的63例無(wú)血緣關(guān)系的非 RDS而死亡的新生兒為對(duì)照組，分組方式與 RDS組以 1∶1相對(duì)應(yīng)．結(jié)果：RDS組中，肺部表面活性物質(zhì)蛋白B（SP-B）mRNA陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量隨胎齡增加保持不變，而對(duì)照組中，肺部表面活性物質(zhì)蛋白 B（SP-B）mRNA陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量隨胎齡增加而升高．RDS組肺部表面活性物質(zhì)蛋白 B（SP-B）mRNA陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)水平顯著小于對(duì)照組．RDS組肺表面活性物質(zhì)蛋白SP-B缺陷頻率為14．29%，明顯大于對(duì)照組（1．59%）；RDS組肺表面活性物質(zhì)蛋白 SP-BmRNA缺陷頻率42．86%，也明顯大于對(duì)照組7．94%．結(jié)論：SP-BmRNA的缺失也是引發(fā) RDS病的因素之一．

呼吸窘迫綜合征；新生兒；肺表面活性物質(zhì)蛋白 B

0 引言

引發(fā)新生兒呼吸系統(tǒng)衰竭的常見(jiàn)病癥之一就是新生兒呼吸窘迫綜合征（NRDS），這種疾病也正是新生兒尤其是早產(chǎn)兒最致命的死亡病因．NRDS病發(fā)的關(guān)鍵機(jī)理在于因?yàn)樾律鷥簷C(jī)體內(nèi)部缺少相關(guān)的肺泡表面活性物質(zhì)（pulmonary surfactant，PS），從而使得機(jī)體肺泡的表面作用力變大，大量的肺泡出現(xiàn)塌癥狀．肺泡表面活性物質(zhì)是由上皮細(xì)胞分泌的一種復(fù)雜的磷脂蛋白，它的主要功能就是對(duì)維護(hù)新生兒肺部呼吸能力并且使得肺泡的表層張力減?。畯哪壳暗难芯拷Y(jié)果可以看出，SP肺表面活性蛋白-B抗體的缺失與Respiratory Distress Syndrome（RDS）的發(fā)生息息相關(guān)［1］，然而上位基因的序列往往會(huì)調(diào)節(jié)控制蛋白的表達(dá)情況．本論文的目的主要是研究 SP肺表面活性蛋白-B抗體的異常與 RDS的發(fā)生情況的相關(guān)性，我們從基因以及蛋白兩方面的標(biāo)準(zhǔn)選擇我院從 2011-09／2013-09兩年之內(nèi)在新生兒監(jiān)護(hù)病房（neonatal intensive care unit，NICU）治療的死亡的 RDS病患，并分析研究其 SP-B的狀況．

1 資料和方法

1．1 一般資料 選取我院 2011-09／2013-09入院的由于 RDS致死的新生兒病例 63例，命名為 RDS組，隨后選取的對(duì)照組則為同一時(shí)期由于其他因素致死的63例新生的嬰兒，其中死亡因素有肺部支氣管先天發(fā)育不全、休克以及先天性心臟病等病癥，以此同時(shí)，這些病例都與RDS組的各個(gè)方面相似，比如性別、重量、年齡、孕婦的生產(chǎn)時(shí)間以及分娩的手段等很多條件．

RDS組與對(duì)照組依照次序的先后，每組分別有21例病患，并將其歸入胎齡小于等于 31周、胎齡為32～36周之間和胎齡大于等于 37周，并且符合患兒與患兒之間沒(méi)有任何血緣關(guān)系的要求，家屬知情同意尸檢．

1．2 方法

1．2．1 肺組織取材 對(duì)研究的所需死亡的患兒均將其肺組織取出，時(shí)間限制在其死亡后的30 min之內(nèi)．RDS組分別在死亡患兒的五葉肺部位切取肺部組織一小塊，而在對(duì)照組的死亡病患隨機(jī)的在肺部切取肺組織的其中一小塊．在切取肺組織后的研究所需死亡的患兒應(yīng)當(dāng)將其馬上浸沒(méi)在多聚甲醛（4%）溶液中使其固化，再用石蠟包裹掩埋之后，連續(xù)切片 5 μm．

1．2．2 免疫印跡分析 SP-B蛋白在肺部的表達(dá) 肺組織將被研磨成碎片，與裂解緩沖液配制成1∶5的比例，在4℃的溫度下，離心機(jī)中以12 000 r／min的轉(zhuǎn)速離心1 h，將 SDS凝膠置于10 L的上清液并加入緩沖液然后對(duì) SDS凝膠進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，完成電泳步驟之后將其轉(zhuǎn)移到了硝酸纖維素的薄膜之上，隨后再用Tris-HCl緩沖溶液（TBS）Tween20進(jìn)行洗滌，在3%濃度的牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）中封閉一小時(shí)，3%BSA與兔抗人SP-B多克隆抗體按照1 ∶3 000的比例進(jìn)行稀釋?zhuān)S后酸纖維素膜將會(huì)被放置在溶液中，在 4℃的條件下放置過(guò)夜，將硝酸纖維素膜置于搖床上1×TBST的溶液中振動(dòng)洗滌三次，堿性磷酸酶標(biāo)示過(guò)的二抗性羊抗兔蛋白 IgG與TBST依據(jù)1∶5 000的比例進(jìn)行稀釋?zhuān)c此同時(shí)，硝酸纖維素膜將會(huì)被置于內(nèi)部，在室溫條件下放置2 h，搖床均勻振動(dòng)．

1．2．3 SP-BmRNA陽(yáng)性細(xì)胞表示的定性以及定量準(zhǔn)則 黃色顯色劑二氨基聯(lián)苯胺 DAB液著色之后，若有棕黃色的顆粒出現(xiàn)在胞漿中，則說(shuō)明表達(dá)出的信號(hào)為雜交陽(yáng)性，如果細(xì)胞的胞漿被著色染成棕黃的顏色則診斷其為 SP-BmRNA表現(xiàn)為陽(yáng)性，隨后采用四百倍的放大顯微鏡計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量，每個(gè)大網(wǎng)格為1個(gè)視野，其是由一百個(gè)小格子構(gòu)成．

1．2．4 SP-BmRNA缺失個(gè)體調(diào)查 SP-BmRNA相對(duì)標(biāo)示量標(biāo)準(zhǔn)下限等于平均值減去兩倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差（x－2s），而 SP-BmRNA相對(duì)標(biāo)示量比對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)下限的個(gè)體值更低，將其診斷為缺失SP-BmRNA．

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用 SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析患者資料，采用 t檢驗(yàn)比較計(jì)數(shù)的資料，并以±s表示；兩組內(nèi)部的比較利用單因素方差進(jìn)行研究，SP-B蛋白的缺失之間的比較應(yīng)用配對(duì)四格表χ2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P＜0．05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

2 結(jié)果

2．1 臨床資料 患有RDS的新生兒在出生以后的0．5～6 h病發(fā)，臨床癥狀表現(xiàn)為進(jìn)行性持續(xù)的呼吸困難癥狀，血?dú)鈹?shù)值顯示出低氧血與高碳酸血癥，診斷胸片確定為 III級(jí)和 IV級(jí)的呼吸窘迫綜合征，在住院期間患兒采用豬肺磷脂一次又一次復(fù)診，給藥量為每次200 mg／kg，每天用藥3～4次，都需要頻率比較高的振動(dòng)伴隨著機(jī)械性的接通氣體，患兒由于生病致使死亡或者由于經(jīng)濟(jì)拮據(jù)從而放棄對(duì)新生兒進(jìn)行治療，在出生后的兩周之間死亡的 RDS患兒病癥為 IV級(jí)者，大多數(shù)患兒在7 d之內(nèi)由于患病而導(dǎo)致自然死亡．

2．2 肺部 SP-BmRNA表示陽(yáng)性細(xì)胞的類(lèi)比分析SP-BmRNA在對(duì)照組表示出的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（53．28± 10．74）要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于 RDS組（33．11±14．85），說(shuō)明RDS組減小顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而RDS組組中比較，胎齡增大，SP-BmRNA在肺部陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表示沒(méi)有隨之而增多，然而相對(duì)于對(duì)照組，在胎齡增大情況下，肺部SP-BmRNA表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量隨之顯著增多．對(duì)于大于或者等于 32周的亞組，mRNA表示陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，RDS組明顯小于對(duì)照組；而在32～36周的亞組中，RDS組細(xì)胞數(shù)仍然小于對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)量；在大于或者等于37周的亞組比較中，RDS組的細(xì)胞數(shù)量相對(duì)對(duì)照組顯著減少．表 1為肺部SP-BmRNA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量在組間和組內(nèi)以及亞組之間的比較．

表1 肺部SP-B mRNA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞子在組間以及組內(nèi)亞組之間的比較

2．3 蛋白 SP-B以及 SP-BmRNA相對(duì)表示呈現(xiàn)的趨勢(shì) 蛋白 SP-B在 RDS組缺失幾率為14．29%，顯著高于對(duì)照組的 1．59%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），RDS組SP-BmRNA缺陷頻率為42．86%，也顯著高于對(duì)照組的7．94%．

3 討論

過(guò)去的研究表明，呼吸窘迫綜合征主要在早產(chǎn)兒身上發(fā)生，然而在新生兒診療技術(shù)越來(lái)越發(fā)達(dá)的當(dāng)今，RDS的發(fā)生幾率在足月兒身上也是逐年增高．近幾年，世界頂尖研究以及相關(guān)的臨床病癥顯示，多基因和許多復(fù)雜的原因是 RDS發(fā)病的主要因素，然而基因控制調(diào)節(jié)在 RDS的發(fā)病機(jī)理中可能占據(jù)了重要的功效．雖然 PS的混合物中 SP-B蛋白只是僅僅占了其中1%～2%的量，但是 SP-B蛋白仍然是確保正常呼吸的肺表面活性劑功效中最為重要的肺表面活性蛋白質(zhì)，蛋白SP-B使得表面活性物質(zhì)能在肺泡的氣液介質(zhì)上面快速伸展以及加快深入表面單獨(dú)每一層的速率和確保表面活性物質(zhì)功效的實(shí)施，使肺泡表面的作用力逐漸減小，從而防止肺泡的坍塌．與此同時(shí)，蛋白 SP-B還是構(gòu)成肺和形成管狀骨髓必須具備的一部分，構(gòu)成這些部分必須有SP-C的加入．最近的調(diào)查顯示，SP-B蛋白的基因遺傳和 RDS在新生兒患者中阻塞性慢性肺氣腫等病癥息息相關(guān)，而且目前國(guó)內(nèi)的研究已經(jīng)逐漸開(kāi)展并且也已經(jīng)取得了初步良好的效果［2］，但蛋白 SP-B降低的發(fā)病因素我們還尚未研究清楚．人們對(duì)SP-B基因缺失越來(lái)越表現(xiàn)出理解的態(tài)度，并且渴望為新生兒相關(guān)病例的臨床診療和治愈開(kāi)辟更加廣闊的學(xué)術(shù)新天地．

［1］尹曉娟，李麗華，王 艷，等．新生兒呼吸窘迫綜合征患兒肺表面活性物質(zhì)蛋白B表達(dá)的研究［J］．中國(guó)新生兒科雜志，2011，26：336－339．

［2］尹曉娟，謝 露，池 婧，等．SP-B遺傳缺陷導(dǎo)致足月新生兒呼吸窘迫綜合征3例［J］．中國(guó)新生兒科雜志，2011，26（4）：268．

The study of possible mechanism of surfactant protein B participate in neonatal respiratory distress syndrome

LU Fen
Department of Neonatology，F(xiàn)irst People's Hospital of Tancheng，Tancheng 276100，China

AIM：To explore the possible mechanism of the lung surface active substance protein B（SP-B）in neonatal respiratory distress syndrome（RDS）．METHODS：Selected from September 2011 to September 2013，63 cases of unrelated newborns dying of RDS were set as RDS group，of which there were 31 weeks or less group，32～36 weeks group and 37 weeks or more group，21 cases in each group；63 cases of newborn，unrelated，death from other diseases，were set as the control group，to match the gestational age with the RDS group at 1∶1．RESULTS：RDS group，lung SP-BmRNA positive cells number did not increase with the increase of gestational age，whereas the control lung SPBmRNA positive cells number increased with the increase of gestational age．SP-BmRNA positive expression cells in RDS group were obviously lower than the control group．Defect frequency of B protein in RDS group was 14．29%，significantly higher than the control group's 1．59%；RDS group's SP-BmRNA defect frequency was 42．86%，which was also significantly higher than the control group's 7．94%．CONCLUSION：SP-BmRNA defects involved in the pathogenesis of RDS．

respiratory distress syndrome；newborn；lung surface active substances protein B

2095-6894（2014）05-035-03

2014-05-22；接受日期2014-06-09

陸 芬．本科，副主任醫(yī)師．研究方向：新生兒．Email：liuyilei88888＠163．com

R722．1

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