阻斷胸導(dǎo)管淋巴回流減輕急性出血壞死性胰腺炎引起肺損傷的機制研究

張 彬，賀德棟，赫 鵬 （新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院普通外一科，河南 衛(wèi)輝453100）

·基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學·

阻斷胸導(dǎo)管淋巴回流減輕急性出血壞死性胰腺炎引起肺損傷的機制研究

張 彬，賀德棟，赫 鵬 （新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院普通外一科，河南 衛(wèi)輝453100）

目的：探討急性出血壞死性胰腺炎引起急性肺損傷（ALI）的發(fā)病機制．方法：將成年雄性 Wistar大鼠 36只隨機分為假手術(shù)組、急性出血壞死性胰腺炎組和AHNP＋胸導(dǎo)管結(jié)扎組三組．采用胰膽管逆行注入牛磺膽酸鈉建立急性出血壞死性胰腺炎模型，測定血清腫瘤壞死因子（TNF-α）水平及胰腺、肺臟、小腸組織髓過氧化物酶（MPO）活性，測定大鼠的支氣管肺泡灌洗液蛋白含量和 TNF-α水平．光鏡下觀察大鼠肺、小腸、胰腺組織病理損傷情況．結(jié)果：AHNP組血清 TNF-α水平和支氣管肺泡灌洗液蛋白含量均高于假手術(shù)組，胰腺、肺臟、小腸MPO活性和病理損傷評分均顯著高于假手術(shù)組；AHNP＋胸導(dǎo)管結(jié)扎組 TNF-α水平和支氣管肺泡灌洗液蛋白含量較 AHNP組明顯降低，肺組織 MPO活性和病理損傷評分均顯著低于 AHNP組，而在小腸和胰腺 MPO活性和病理損傷評分較 AHNP組升高．結(jié)論：腹腔淋巴液是 AHNP引起 ALI的可能原因，阻斷胸導(dǎo)管淋巴回流可以減輕 AHNP引起的急性肺損傷．

胸導(dǎo)管結(jié)扎；急性出血壞死性胰腺炎；急性肺損傷

0 引言

急性出血壞死性胰腺炎（acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis，AHNP）臨床過程兇險，其病死率高［1－2］．目前研究證實，AHNP引起急性肺損傷（acute lung injury，ALI）高達60% ～70%［3－4］，而急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是急性肺損傷的一個終末結(jié)局，成為 AHNP的主要死亡原因［5－6］．因此，尋找減輕急性肺損傷的方法對降低 AHNP的死亡率及改善疾病的預(yù)后具有重要意義．有研究發(fā)現(xiàn)，淋巴循環(huán)可以介導(dǎo)急性肺損傷，并進而導(dǎo)致肺和全身的炎癥反應(yīng)，本研究通過阻斷急性出血壞死性胰腺炎大鼠的胸導(dǎo)管，阻斷腹腔淋巴液進入肺，觀察其對急性肺損傷的影響，探討 AHNP時 ALI的發(fā)病機制．

1 材料和方法

1．1 材料 成年雄性Wistar大鼠36只，體重（250± 20）g，由中國醫(yī)學科學院輻射實驗動物中心提供．將動物保持在12 h光照／黑暗周期與自由飲水和標準飼料．經(jīng)過7 d馴化后被隨機分為3組，每組12只．

1．2 主要試劑 腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）試劑盒購自晶美生物工程有限公司，髓過氧化酶（myeloperoxidase，MPO）檢測試劑盒、蛋白測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所．

1．3 急性出血壞死性胰腺炎模型建立 稱重后戊巴比妥鈉60 mg／kg腹腔注射麻醉，成功后大鼠仰臥位

并無創(chuàng)固定四肢于實驗臺，頸部常規(guī)消毒鋪單，于左或右側(cè)下領(lǐng)角下方作橫行切口，切開皮膚約 1．0 cm，于皮下找到頸靜脈，充分游離，靜脈遠端結(jié)扎，于結(jié)扎線近端血管穿刺并置入硅膠管（硬膜外麻醉管），1號線縫扎固定后尋找十二指腸縫合皮膚．腹部備皮，消毒鋪巾，腹部取劍突下正中切口，長約 1．5 cm，進腹后沿幽門，將其提至切口外，暴露十二指腸胰膽管入口處，用7號針頭穿刺胰膽管開口對側(cè)十二指腸壁，將拉細的硬膜外導(dǎo)管于穿刺口插入，經(jīng)胰膽管開口輕輕導(dǎo)入胰膽管內(nèi)約0．5 cm，1號線縫扎固定，用小動脈夾夾閉胰膽管近肝端，以0．24 mL／min的速度注射35 g／L牛磺膽酸鈉（1．1 mL／kg），注射后保持壓力 3 min，觀察胰腺出現(xiàn)水腫、出血、壞死等改變后，去血管夾、拆線、拔管．無損傷線修補十二指腸穿刺口的漿肌層，十二指腸復(fù)位，關(guān)閉腹腔．

1．4 分組 假手術(shù)組：麻醉后開腹，僅輕輕翻動胰腺后關(guān)腹；急性出血壞死性胰腺炎（AHNP）組：按上述模型的操作步驟處理，注意動作輕柔，避免血管出血；AHNP＋胸導(dǎo)管結(jié)扎組（AHNP＋結(jié)扎組）：顯露壁層腹膜的覆蓋左腎的部分，于腹主動脈左后方查找淡乳白色的乳糜池及胸導(dǎo)管．在腎上腺至隔腳段分離出乳糜池及胸導(dǎo)管，結(jié)扎胸導(dǎo)管近心端，余步驟同 AHNP組．

1．5 標本的采集 注射牛磺膽酸鈉 6 h后，處死動物，采集下腔靜脈血5 mL，其中 1 mL置分離血清（3 000 r／min，3 min）進行血清內(nèi)毒素檢測；2 mL進行血清淀粉酶的測定，其余2 mL置于離心管中，分離血清（500 r／min，30 min），用于血清TNF-α測定．開胸后肺被仔細解剖至氣管隆突水平，左主干支氣管結(jié)扎．分別對右側(cè)肺三個支氣管內(nèi)滴注3 mL PBS液進行灌洗液，保持在肺中為3 min，并通過重力回收到管內(nèi)，回收約7．5 mL．支氣管肺泡灌洗液離心（4 000 r／min，10 min）后，取上清液 －30℃冰箱保存?zhèn)溆茫疅o菌操作下切取部分小腸、胰腺及左肺組織，將所取標本一部分于甲醛溶液中固定 48 h，經(jīng)脫水透明、浸蠟、包埋后，切成4 μm石蠟切片 HE染色．另一部分組織用生理鹽水洗三次，清除殘血，用濾紙吸干，取小腸黏膜組織、左肺組織及胰腺組織各0．5 g，分別加入40℃磷酸鹽緩沖溶液 5 mL制成勻漿，勻漿液離心3 500 r／min，離心1 min，取上清－70℃冰箱保存．采用比色法測定血清和組織勻漿中 MPO活性，采用ELISA法測定血清 TNF-α，自動生化分析儀測定血淀粉酶水平．

2 結(jié)果

2．1 胸導(dǎo)管結(jié)扎對 AHNP大鼠肺、小腸、胰腺組織病理損傷的影響 假手術(shù)組鏡下可見肺泡輕度水腫，小腸黏膜絨毛完整，胰腺組織基本正常，各臟器組織未見中性粒細胞浸潤．AHNP組鏡下可見小腸絨毛破損，上皮細胞水腫明顯，胰腺組織廣泛出血壞死，大量炎性細胞浸潤，肺泡組織彌漫性毛細血管擴張充血，肺泡間隔重度水腫，部分已破裂．AHNP＋胸導(dǎo)管結(jié)扎組鏡下見小腸黏膜和胰腺組織損傷程度同 AHNP組相近，肺泡組織血管充血程度較AHNP減輕，肺泡間隔中度水腫．具體病理評分見表1．

表1 各組 AHNP大鼠臟器病理評分的對比 （n＝12）

2．2 各組AHNP大鼠肺臟、小腸、胰腺MPO活性的變化 AHNP組的各臟器MPO活性顯著高于假手術(shù)組；AHNP＋結(jié)扎組肺組織 MPO較 AHNP組明顯下降，而小腸和胰腺MPO較AHNP組顯著升高（表2）．

表2 各組AHNP大鼠肺臟、小腸、胰腺MPO活性的變化（n＝12，U／g）

2．3 各組 AHNP大鼠血清淀粉酶和 TNF-α的變化

AHNP組較假手術(shù)組血清淀粉酶和 TNF-α均顯著升高，AHNP＋結(jié)扎組與 AHNP組比較，血淀粉酶無明顯變化，而TNF-α顯著下降（表3）．

表3 各組 AHNP大鼠血清淀粉酶、TNF-α的變化 （n＝12）

2．4 阻斷腹腔淋巴流對各組 AHNP大鼠的支氣管肺泡灌洗液蛋白和 TNF-α的影響 AHNP組較假手術(shù)組支氣管肺泡灌洗液蛋白和 TNF-α水平均顯著升高，AHNP＋結(jié)扎組氣管肺泡灌洗液蛋白和 TNF-α水平較AHNP組均顯著降低（表4）．

表4 各組 AHNP大鼠支氣管灌洗液（BALF）蛋白與 TNF-α的水平變化 （n＝12）

3 討論

急性出血壞死性胰腺炎臨床過程兇險，其病死率高，其炎癥的始動因素是胰腺腺泡內(nèi)胰酶異常激活，繼而引起全身反應(yīng)［2，7］，急性肺損傷是機體過度炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞廣泛破壞的結(jié)果［3］．通過在重度燒傷、感染性休克的研究中發(fā)現(xiàn)，腸系膜-胸導(dǎo)管淋巴液可以介導(dǎo)嚴重感染／創(chuàng)傷等引起的肺臟損傷，臨床及動物實驗發(fā)現(xiàn)各種原因引起的多器官功能障礙綜合癥常首先出現(xiàn)ARDS，而肺是首個接納腸系膜淋巴液的器官，腹腔淋巴液可能起著介導(dǎo)肺損傷的作用［8－9］．MPO是中性粒細胞胞質(zhì)中的一種特異性酶，組織中 MPO水平可間接反映中性粒細胞浸潤和激活的程度［10］，本實驗發(fā)現(xiàn)，AHNP組小腸、胰腺、肺臟組織 MPO含量均比假手術(shù)組明顯升高，而胸導(dǎo)管結(jié)扎組小腸、胰腺較 AHNP組顯著升高，而肺組織MPO較AHNP組顯著下降，而且肺組織的病理損傷較 AHNP組明顯減輕，其原因可能是胸導(dǎo)管結(jié)扎后小腸淋巴液進入肺臟通路被阻斷，小腸內(nèi)毒素與炎性介質(zhì)無法進入肺臟有關(guān)，而且胸導(dǎo)管結(jié)扎可以減輕肺組織中性粒細胞浸潤，啟動細胞的內(nèi)源性保護機制，進而提高抗氧化能力，減輕組織損傷．TNF-α是由激活的巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、中性粒細胞等分泌的具有多功能的多肽，在炎癥反應(yīng)過程中起著十分重要的作用［11］．TNF-α可以誘導(dǎo)氧自由基的產(chǎn)生，促進中性粒細胞產(chǎn)生氧自由基等活性氧遞質(zhì)并導(dǎo)致組織損傷［12－13］．本實驗發(fā)現(xiàn)胸導(dǎo)管結(jié)扎組血清和肺組織中 TNF-α含量和支氣管灌洗液的蛋白含量均較AHNP組下降，提示胸導(dǎo)管結(jié)扎后肺泡通透性明顯減輕，使肺組織的中性粒細胞的聚集減輕，進而減少TNF-α的激活，抑制炎癥級聯(lián)反應(yīng)，減輕肺臟損傷．

綜上所述，急性出血壞死性胰腺炎早期即可引起急性肺損傷，胸導(dǎo)管結(jié)扎可減少肺組織中性粒細胞浸潤和腫瘤壞死因子-α釋放，減輕肺損傷，但對小腸和胰腺損傷無明顯改善，提示腹腔淋巴液回流是急性出血壞死性胰腺炎引起急性肺損傷的可能原因．

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Blocking thoracic duct lymph flow attenuates acute hemorrhagicnecrotizing pancreatitis associated lung injury in rats

ZHANG Bin，HE De-Dong，HE Peng
Department of General Surgery，F(xiàn)irst Affiliated，Xingxiang Medical university，Weihui 453100，China

AIM：To investigate the pathogenesis of acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis induced acute lung injury（ALI）．METHODS：36 male Wistar rats were randomly divided into 3 groups：sham operation group，AHNP group，AHNP＋Ligation of thoracic duct group．Rat AHNP model was induced by retrograde injection of 3．5%sodium deoxycholate into the biliopancreatic duct．At 6 h after model induction，the bronchoalveolar lavage fluid（BALF）were collected for determination of tumor necrosis factor-alpha（TNF-α），and the tissues of lung，intestine and pancrease were harvested individually for pathohistological evaluation and the myeloperoxidase（MPO）activity determination in each group．RESULTS：The pathohistological damage and MPO of lung，intestine and pancrease，TNF-α of BALF and serum were all increased in AHNP group compared to those in sham operation group．In AHNP＋ligation group，the pathohistological damage and MPO of lung and TNF-α of BALF were reduced，but the pathohistological damage and MPO of intestine and pancrease were increased compared with AHNP group．CONCLUSION：Abdominal lymphatic is the pathogenesis of ALI induced by AHNP，thoracic duct ligation can reduce neutrophil infiltration and TNF-α release and then attenuates lung injury in rats with AHNP．

thoracic duct ligation；thoracic duct drainage；acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis；acute lung injury

2095-6894（2014）05-006-03

2014-08-12；接受日期：2014-08-25

張 彬．碩士，主治醫(yī)師．研究方向：腸缺血再灌注損傷．E-mail：binbin801215＠163．com

R657．5＋1

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