慢性阻塞性肺疾病模型大鼠骨骼肌組織中Caspase-12和m-Calpain的表達(dá)

王富霞，夏熙鄭，劉待見

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 鄭州 450014

慢性阻塞性肺疾病模型大鼠骨骼肌組織中Caspase-12和m-Calpain的表達(dá)

王富霞，夏熙鄭#，劉待見

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 鄭州 450014

#通訊作者，男，1955年12月生，本科，教授，研究方向：慢性阻塞性肺疾病和呼吸系統(tǒng)感染性疾病，E-mail：xiaxizheng@126.com

慢性阻塞性肺疾??；骨骼肌萎縮；Caspase-12；m-Calpain；細(xì)胞凋亡；大鼠

目的：探討慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠骨骼肌組織中Caspase-12和m-Calpain的表達(dá)情況。方法將40只健康雄性Wistar大鼠隨機分為COPD模型組和對照組各20只，模型組采用反復(fù)熏香煙加氣道內(nèi)滴豬胰彈性蛋白酶法建立COPD模型。采用TUNEL法測定2組大鼠骨骼肌(膈肌、趾長伸肌)細(xì)胞凋亡率，采用免疫組化法、RT-PCR檢測2組大鼠骨骼肌內(nèi)Caspase-12和m-Calpain蛋白及mRNA的表達(dá)。結(jié)果與對照組相比，模型組大鼠膈肌、趾長伸肌的凋亡率增加(t=23.190和28.184，P<0.001)，Caspase-12和 m-Calpain 蛋白和mRNA的表達(dá)亦增強(P<0.001)。模型組大鼠膈肌、趾長伸肌中Caspase-12和m-Calpain 蛋白與mRNA的表達(dá)有關(guān)(r=0.885和0.787，P<0.05；r=0.862和0.774，P<0.05)。結(jié)論Caspase-12可能參與 COPD 大鼠骨骼肌萎縮，m-Calpain可能通過激活 Caspase-12 參與該過程。

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以氣流受限為特征的肺部疾病，氣流受限不完全可逆，呈進(jìn)行性發(fā)展，有較高的致死率和致殘率[1]，常伴有不明原因的骨骼肌萎縮[2]，嚴(yán)重的骨骼肌萎縮降低了患者的鍛煉耐受力和生活質(zhì)量。有研究[3]發(fā)現(xiàn)COPD模型大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡過程中Caspase-8和Caspase-9 明顯表達(dá)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑中的Caspase-12是否參與COPD大鼠骨骼肌的萎縮過程，目前國內(nèi)未見報道。作者檢測了COPD模型大鼠骨骼肌中Caspase-12及m-Calpain蛋白和mRNA的表達(dá)，探討其在COPD大鼠骨骼肌萎縮中的意義。

1 材料與方法

1.1實驗材料紅旗渠牌香煙(河南中煙安陽卷煙廠，尼古丁1.0 mg/支，焦油12 mg/支)，豬胰彈性蛋白酶(Sigma公司分裝，上海森雄科技實業(yè)有限公司代理)，原位細(xì)胞凋亡TUNEL檢測試劑盒(法國羅氏公司)，Caspase-12及m-Calpain抗體(上海晶天生物科技有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和 DNA Marker(Transgene公司)，Caspase-12免疫熒光試劑盒(北京中杉金橋生物工程技術(shù)有限公司)，小動物肺功能測定系統(tǒng)HX200型呼吸流量換能器(北京新行興業(yè)科貿(mào)有限公司)，PCR儀(德國Eppendorf公司)，LOGENEPAS900病理圖像分析系統(tǒng)(上海山富科學(xué)儀器有限公司)，采用大連競邁生物電泳圖像分析軟件進(jìn)行電泳條帶掃描分析。

1.2實驗動物分組及模型制備8～10周齡清潔級雄性Wistar大鼠40只(河南省實驗動物中心)，體重(200±20) g，按隨機數(shù)字表法分為對照組(20只)、模型組(20只)。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，模型組大鼠在第1～29天、第31～60天在自制密閉染毒箱內(nèi)熏紅旗渠牌香煙，2次/d，每次持續(xù)0.5 h，持續(xù)2個月，煙熏第30天，氣管內(nèi)注射入豬胰彈性蛋白酶200 U/kg)。對照組在模型組氣管內(nèi)注入豬胰彈性蛋白酶當(dāng)天以相同術(shù)式氣管內(nèi)注入等體積注射用生理鹽水，余不做任何干預(yù)。

1.3肺功能測定第60天，按陳濤等[4]描述的方法，隨機在每組中選取10只大鼠測定第0.3秒用力呼氣容積(FEV0.3)、第0.3 秒用力呼氣容積占用力呼氣容積的百分比(FEV0.3/FVC)及最大呼氣流速(PEF)：大鼠用水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉后， 固定于鼠板， 縱向剪開頸部皮膚，鈍性分離皮下組織及胸骨舌骨肌，暴露氣管，組織剪在氣管軟骨環(huán)之間水平剪破氣管，插入Y形管，連接HX200型呼吸流量換能器，應(yīng)用MS4000U-IC生物信號定量記錄分析系統(tǒng)，經(jīng)微機處理計算上述指標(biāo)。

1.4組織標(biāo)本采集剩余大鼠均在第61天用水合氯醛(3 mL/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，行腹主動脈抽血處死，先快速分離右側(cè)趾長伸肌，將其平均分為兩部分，一部分放入DEPC預(yù)處理過的凍存管中，立即投入液氮罐中凍存，另一部分放入40 g/L多聚甲醛固定液中；再快速分離整個膈肌，左右剪開膈肌分成兩部分，左側(cè)放入DEPC預(yù)處理過的凍存管中，立即投入液氮罐中凍存，右側(cè)放入40 g/L多聚甲醛固定液中。用40 g/L多聚甲醛液注入右心室灌注雙肺至白色，取出肺組織，放入40 g/L多聚甲醛固定液中。

1.5 2組大鼠肺組織和骨骼肌病理學(xué)觀察取出已固定24 h以上的肺組織和骨骼肌(膈肌和趾長伸肌)組織，石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅染色后光學(xué)顯微鏡觀察骨骼肌和肺組織病理改變。

1.6骨骼肌細(xì)胞凋亡率測定采用TUNEL技術(shù)測定，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。每張切片取5個不相關(guān)高倍視野進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。凋亡細(xì)胞核呈黃色或棕黃色，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色。細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/(凋亡細(xì)胞數(shù)+正常細(xì)胞數(shù))×100%。

1.7 2組大鼠膈肌、趾長伸肌組織中Caspase-12和m-Calpain蛋白表達(dá)的測定采用免疫組化SP法。嚴(yán)格按各試劑盒說明書進(jìn)行操作。每張切片取5個高倍視野，應(yīng)用Biosens Digital Imaging System v1.6圖像處理系統(tǒng)對Caspase-12和m-Calpain蛋白進(jìn)行半定量分析，用積分光密度值進(jìn)行分析。

1.8 2組大鼠膈肌、趾長伸肌組織中Caspase-12和m-CalpainmRNA表達(dá)的測定取一小塊膈肌或趾長伸肌(約100 mg)至研缽內(nèi)，加液氮研磨，加入1 mL Trizol試劑抽提RNA，RNA純度及完整性檢測和RT-PCR操作步驟均按照試劑盒說明書進(jìn)行。Caspase-12上游引物序列5’-TCCTGGTCTTTATGTC CC-3’，下游引物序列5’-TATTCCATCTATGGCTCA-3’，擴增產(chǎn)物大小為261 bp；m-Calpain上游引物序列5’-ACCCAGCGACCTCTACCA-3’，下游引物序列5’-CCGTCCTCCATCTTGACC-3’，擴增產(chǎn)物大小為306 bp。GAPDH上游引物序列5’-CACGGCAAGT TCAACGGCACA-3’，下游引物序列5’-GCGGCATGT CAGATCCACAACG-3’，擴增產(chǎn)物大小為588 bp。擴增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，置于暗箱式紫外透射儀中成像，軟件分析計算灰度值。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，應(yīng)用兩獨立樣本t檢驗比較2組大鼠各項指標(biāo)的差異，相關(guān)分析應(yīng)用Pearson相關(guān)分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠一般情況模型組大鼠皮毛黃澀，活動減少，有明顯的咳嗽、喘息、臥底弓背等呼吸困難的表現(xiàn)。對照組大鼠觀察期內(nèi)無異常表現(xiàn)。

2.2 2組大鼠肺組織、膈肌和趾長伸肌病理結(jié)果見圖1。模型組大鼠支氣管黏膜存在著不同程度的炎癥改變，包括炎性細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等)增加，黏液腺增大，氣道壁增厚，氣道上皮的破壞，氣道炎性滲出及肺氣腫等表現(xiàn)。對照組大鼠膈肌肌纖維飽滿，排列整齊，染色均勻，胞核位于肌膜下，排列規(guī)則，大小一致；模型組膈肌肌纖維萎縮，變細(xì)變薄，染色不均勻，部分可見崩解、斷裂、壞死，炎性細(xì)胞浸潤，結(jié)構(gòu)排列紊亂、松弛，細(xì)胞核排列不規(guī)則，大小不一。對照組大鼠趾長伸肌肌纖維結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，橫紋清晰可見，多個細(xì)胞核呈扁橢圓形分布在胞質(zhì)周邊；模型組大鼠趾長伸肌肌纖維排列疏松，細(xì)胞核大小不一，骨骼肌纖維有變性、斷裂，橫紋消失，可見炎性細(xì)胞浸潤，提示骨骼肌纖維出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象。

圖1 2組大鼠肺組織、膈肌和趾長伸肌病理結(jié)果(HE,×200)

2.3 2組大鼠肺功能檢測見表1。

表1 2組大鼠肺功能的比較

2.4 2組大鼠膈肌、趾長伸肌細(xì)胞凋亡率測定見表2、圖2。模型組大鼠膈肌、趾長伸肌細(xì)胞凋亡率高于對照組。

2.5 2組大鼠膈肌、趾長伸肌組織內(nèi)Caspase-12和m-Calpain蛋白的表達(dá)見表3。模型組大鼠膈肌、趾長伸肌組織內(nèi)Caspase-12和m-Calpain蛋白的表達(dá)均高于對照組。

表2 2組大鼠膈肌、趾長伸肌細(xì)胞凋亡率比較 %

圖2 2組大鼠大鼠膈肌、趾長伸肌細(xì)胞凋亡比較(SP，×400)

表3 2組大鼠膈肌、趾長伸肌組織內(nèi)Caspase-12和m-Calpain蛋白的表達(dá)

2.6 2組大鼠膈肌、趾長伸肌組織內(nèi)Caspase-12和m-CalpainmRNA的表達(dá)見圖3、表4。

圖3 2組大鼠膈肌(上)、趾長伸肌(下)組織內(nèi)Caspase-12和m-Calpain mRNA的表達(dá)

表4 2組大鼠膈肌、趾長伸肌組織內(nèi)Caspase-12和m-Calpain mRNA表達(dá)的比較

2.7相關(guān)性分析模型組大鼠膈肌中m-Calpain和Caspase-12蛋白與mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.885和0.787，P<0.05)，趾長伸肌中m-Calpain和Caspase-12蛋白與mRNA的表達(dá)也呈正相關(guān)(r=0.862和0.774，P<0.05)。

3 討論

有研究[3]報道COPD患者發(fā)生骨骼肌萎縮的可達(dá)20%～40%。最近的研究[5]表明，細(xì)胞凋亡在骨骼肌萎縮中扮演重要角色，骨骼肌細(xì)胞凋亡增加導(dǎo)致肌肉纖維數(shù)量減少，從而引起COPD患者骨骼肌萎縮和體重減輕。有實驗[6]發(fā)現(xiàn)許多原因引起的骨骼肌萎縮中都伴有細(xì)胞凋亡的增加。該研究中HE染色顯示COPD模型組大鼠膈肌和趾長伸肌組織骨骼肌纖維均出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象。

細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)途徑包括研究較早的死亡受體信號途徑、線粒體路徑及近年來發(fā)現(xiàn)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，后者成為當(dāng)前的研究熱點。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中一種特有的亞細(xì)胞器。當(dāng)環(huán)境毒物、缺氧、病毒等因素刺激時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)腔內(nèi)錯誤折疊、未折疊蛋白聚集以及Ca2+平衡紊亂的狀態(tài)，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生一系列生理變化，對蓄積在網(wǎng)腔內(nèi)的錯誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)進(jìn)行處理，有利于維持細(xì)胞的正常功能并使之存活，但過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可引起細(xì)胞凋亡[7]。Caspase-12存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡過程中起重要的作用[8-9]。正常情況下Caspases-12以非活性的半胱氨酸酶原形式存在，過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可激活Caspase-12，然后激活促凋亡的Caspase-9，進(jìn)而激活凋亡的執(zhí)行分子Caspase-3，最終引起細(xì)胞凋亡。Kalai等[10]研究證明Caspase-12主要在肺部和骨骼肌表達(dá)。有研究[11]顯示Caspase-12在吸煙致COPD大鼠模型肺泡上皮細(xì)胞中表達(dá)增加，即吸煙能夠?qū)е路闻萆掀ぜ?xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)性凋亡。也有研究[12]顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑在老年大鼠骨骼肌萎縮中起重要作用。該實驗顯示，與對照組比較，COPD模型組大鼠膈肌與趾長伸肌中細(xì)胞凋亡率、Caspase-12蛋白及mRNA的表達(dá)水平明顯提高，提示Caspase-12可能參與模型組骨骼肌細(xì)胞凋亡。

鈣蛋白酶家族中最具特點的是m-Calpain和μ-Calpain。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)存放Ca2+的重要容器，當(dāng)細(xì)胞損傷時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲存鈣的能力失衡，引發(fā)Ca2+大量釋放而激活鈣蛋白酶，被激活的鈣蛋白酶從細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至膜系統(tǒng)發(fā)揮蛋白水解作用，將ProCaspase-12切割成Caspase-12，最后激活它[13]，引起一系列細(xì)胞凋亡。鈣蛋白酶激活途徑與很多疾病的形成有關(guān)，如缺血性腦損傷、阿爾茨海默病等[14]，鈣蛋白酶之所以能發(fā)揮這些作用，很大原因是因為激活了Caspase-12。該研究結(jié)果顯示COPD模型組大鼠骨骼肌中的m-Calpain蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著提高，且與Caspase-12有關(guān)，提示m-Calpain可能通過激活Caspase-12促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而參與骨骼肌萎縮的過程。

總之，細(xì)胞凋亡是COPD機制研究中的熱點之一，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了COPD的發(fā)生發(fā)展[15]。該研究表明，Caspase-12介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑可能參與COPD大鼠骨骼肌萎縮過程，m-Calpain可能通過激活Caspase-12而參與其中，但具體機制不明確，有待進(jìn)一步研究。

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(2013-09-22收稿 責(zé)任編輯趙秋民)

Expression of Caspase-12 and m-Calpain in rat skeletal muscle in the COPD model

WANGFuxia，XIAXizheng，LIUDaijian

DepartmentofRespiratoryDisease，theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014

chronic obstructive pulmonary disease；skeletal muscle atrophy；Caspase-12；m-Calpain；cell apoptosis；rat

Aim: To study the expression and significance of Caspase-12 and m-Calpain in COPD rats skeletal muscle atrophy.Methods:A total of 40 healthy male Wistar rats were randomly divided into model group(n=20) and control group(n=20). COPD model rats were copied by tabocco smoke inhalation and intracheally given PEE successfully.Skeletal muscle apoptosis rate was evaluated by TUNEL method.The expression of Caspase-12 and m-Calpain mRNA and protein in rat skeletal muscle were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemical respectively．Results: Compared with control group,the rates of muscle apoptosis in both diaphragmatic muscle and long extensor muscle digits of the model group were increased(t=23.190，28.184；P<0.001),and the expression of Caspase-12 and m-Calpain protein and mRNA were significantly enhanced (P<0.001).Caspase-12 and m-Calpain had significant correlation(r=0.885，0.787，P<0.05；r=0.862，0.774，P<0.05).Conclusion: Reticulum apoptosis pathway, which involving Caspase-12 and m-Calpain, may be responsible for COPD rats skeletal muscle atrophy.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.018

R562