DZNep對Eca109細(xì)胞增殖、凋亡及遷移能力的影響*

王瑞莉，李慶華，張彥婷，毛麗紅，蔣海麗，龔方華，王 靜，1,#，關(guān)方霞#

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院細(xì)胞生物學(xué)研究室 鄭州 450052

DZNep對Eca109細(xì)胞增殖、凋亡及遷移能力的影響*

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院細(xì)胞生物學(xué)研究室 鄭州 450052

#通訊作者：薛樂勛，男，1944年2月生，本科，教授，研究方向：腫瘤標(biāo)志物與基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn；關(guān)方霞，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)，E-mail:guanfangxia@126.com

DZNep；Eca109細(xì)胞；增殖；凋亡；遷移

目的：探討DZNep處理食管鱗狀細(xì)胞癌Eca109細(xì)胞后對其增殖、凋亡及遷移能力的影響。方法DZNep處理Eca109細(xì)胞48 h，以DMSO處理48 h的Eca109細(xì)胞作為對照。采用EdU熒光顯微鏡法檢測細(xì)胞增殖率，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，Transwell小室檢測細(xì)胞遷移數(shù)。結(jié)果DZNep處理后的Eca109細(xì)胞增殖率為(34.60±4.45)%，低于對照組的(42.37±4.64)%(t=3.625，P=0.002)；其細(xì)胞凋亡率為(16.27±3.70)%，高于對照組的(7.38±0.77)%(t=7.061，P<0.001)；遷移到下室的細(xì)胞數(shù)為(179±38)個，較對照組的(494±99)個少(t=8.912，P<0.001)。結(jié)論DZNep能夠抑制Eca109細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)其凋亡。

S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocysteine hydrolase, SAHH)是生物細(xì)胞中廣泛存在的一種蛋白水解酶，也是甲基化通路中一個關(guān)鍵的限速酶。抑制SAHH將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)甲基化抑制物S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine，SAH)的堆積，從而對轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)產(chǎn)生反饋性抑制作用[1]。由于蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等生物分子的甲基化對于維持細(xì)胞的活性是必需的，而且一些細(xì)胞膜信號分子的翻譯后加工也需要甲基化的參與，所以抑制SAHH可能影響這些重要分子的甲基化。鑒于SAHH在調(diào)節(jié)生物體轉(zhuǎn)甲基化反應(yīng)中的核心地位，它已被選擇作為多種新藥研發(fā)的重要潛在靶點(diǎn)，包括免疫抑制劑、抗病毒藥、防治動脈粥樣硬化和阿爾茨海默病藥物。SAHH抑制劑全新的化學(xué)結(jié)構(gòu)、良好的作用效果和獨(dú)特的作用靶點(diǎn)已引起國內(nèi)外研究者廣泛的興趣。3-deazaneplanocin A(DZNep)是最有效的SAHH抑制劑之一，它可以引起胞內(nèi)SAH的積聚進(jìn)而導(dǎo)致S-腺苷蛋氨酸依賴的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的活化被抑制，這對于設(shè)計抗病毒藥物具有重要意義。據(jù)報道DZNep可以抑制乳癌細(xì)胞的增殖[2]，抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖[3]，可用于治療肝癌、急性髓系白血病、多形性膠質(zhì)細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤等[4-7]。但其對食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的影響尚未見報道，且食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展涉及多種抑癌基因及原癌基因[8]。為了探討DZNep對食管鱗狀細(xì)胞癌的作用，該研究以食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Eca109為研究對象，采用DZNep處理Eca109細(xì)胞后檢測細(xì)胞增殖、凋亡及遷移能力的變化，報道如下。

1 材料與方法

1.1材料食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Eca109為鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院細(xì)胞生物學(xué)研究室保存，DZNep購自美國Sigma公司，RPMI 1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶均購自美國HyClone公司，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(FBS)購自天津灝洋生物制品有限公司。EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自廣州銳博生物有限公司，Transwell小室購自美國Corning公司，結(jié)晶紫染色液購自北京碧云天公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)Eca109細(xì)胞使用含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的條件下培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期進(jìn)行處理及后期實驗。

1.3EdU熒光顯微鏡法檢測細(xì)胞增殖收集對數(shù)生長期的Eca109細(xì)胞，以每孔1×105個細(xì)胞接種于96孔板中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)50%～60%融合時，更換新鮮培養(yǎng)基，每孔加入0.5 μL 5 μmol/L DZNep繼續(xù)培養(yǎng)48 h。同時以相同劑量DMSO處理的Eca109細(xì)胞作為對照。用細(xì)胞培養(yǎng)基按體積比1 000:1的比例稀釋EdU溶液，制備成50 μmol/L EdU培養(yǎng)基，每孔加入50 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，棄去培養(yǎng)基。用PBS清洗細(xì)胞2次，每次5 min。每孔加入50 μL細(xì)胞固定液(40 g/L多聚甲醛)，室溫下孵育30 min，棄去固定液；每孔加入50 μL 2 g/L的甘氨酸溶液，脫色搖床孵育5 min，棄去甘氨酸；PBS清洗5 min，每孔加入100 μL滲透劑(含體積分?jǐn)?shù)0.5% TritonX-100的PBS)脫色搖床孵育10 min，然后用PBS清洗5 min。每孔加入50 μL的Apollo?染色反應(yīng)液，避光、室溫下在脫色搖床孵育30 min，棄染色反應(yīng)液；Apollo?染色反應(yīng)液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，最好在30 min內(nèi)用完。然后每孔加入100 μL滲透劑(含體積分?jǐn)?shù)0.5% TritonX-100的PBS)脫色搖床清洗3次，每次10 min，棄滲透劑。每孔加入100 μL甲醇清洗2次，每次5 min，然后用PBS清洗5 min。每孔加入50 μL Hoechst 33342反應(yīng)液，避光、室溫下脫色搖床孵育30 min，棄染色反應(yīng)液；用PBS清洗3次后在熒光顯微鏡下觀察，并用DP-BSW軟件制作覆蓋圖。每組取3個400倍視野，計數(shù)EdU染色細(xì)胞(增殖的細(xì)胞)和Hoechst 33342染色細(xì)胞(總的細(xì)胞)，計算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率=增殖的細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。實驗重復(fù)3次。

1.4細(xì)胞凋亡檢測取對數(shù)生長期的Eca109細(xì)胞，DZNep組用DZNep處理，對照組用DMSO處理，48 h之后取5×105個已處理細(xì)胞，用無EDTA胰蛋白酶對細(xì)胞進(jìn)行消化，PBS清洗，離心并棄掉上清，每管加100 μL的Binding buffer、5 μL Annexin V-FITC及 PI室溫避光孵育20 min，隨后采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。實驗重復(fù)3次。

1.5細(xì)胞遷移能力檢測消化處理后的細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基洗3次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106mL-1，制成單細(xì)胞懸液。用消毒過的鑷子將Transwell小室(無基質(zhì)膠，濾膜孔徑8 μm)夾入24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在下室中加入500 μL 含體積分?jǐn)?shù)5% FBS的培養(yǎng)基。將上述制備好的細(xì)胞懸液300 μL加入上室中。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，取出Transwell小室，用甲醇固定30 min。用PBS洗去小室殘留的甲醇溶液，加入體積分?jǐn)?shù)為1%的結(jié)晶紫，室溫染色30 min。PBS清洗3遍，用棉簽小心擦去上室內(nèi)未遷移的細(xì)胞，光鏡下觀察并計數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，2組間細(xì)胞增殖率、細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞遷移數(shù)的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1DZNep抑制Eca109細(xì)胞增殖結(jié)果見圖1、表1。DZNep組細(xì)胞增殖率低于對照組。

2.2DZNep促進(jìn)Eca109細(xì)胞凋亡見表1。

圖1 DZNep對Eca109細(xì)胞增殖能力的影響(×400)

表1 對照組及DZNep組細(xì)胞增殖率、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞遷移數(shù)比較

2.3DZNep抑制Eca109細(xì)胞遷移見圖2、表1。

圖2 DZNep對Eca109細(xì)胞遷移能力的影響(結(jié)晶紫染色，×400)

3 討論

DZNep是SAHH抑制劑，抑制SAH水解生成同型半胱氨酸和腺苷，SAHH在所有生物系統(tǒng)的調(diào)控甲基穩(wěn)態(tài)方面起關(guān)鍵作用[9]。而后細(xì)胞中SAH的積累導(dǎo)致上游甲硫氨酸代謝(生成SAH)受到抑制。甲硫氨酸代謝是各種依賴性的新陳代謝過程中關(guān)鍵的一步,因此，甲硫氨酸代謝的抑制導(dǎo)致細(xì)胞整體新陳代謝受到抑制[2]。在該研究中，作者采用SAHH抑制劑DZNep處理Eca109細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖率明顯下降，凋亡率明顯升高，遷移至下室的細(xì)胞數(shù)明顯減少，表明DZNep可抑制Eca109細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)其凋亡。

綜上所述，SAHH有望成為食管鱗狀細(xì)胞癌診斷的分子標(biāo)志物，也可能是食管鱗狀細(xì)胞癌基因治療的有效靶點(diǎn)。

[1]姜怡鄧,馬琳娜,劉學(xué)英,等.S-腺苷同型半胱氨酸水解酶在同型半胱氨酸致平滑肌細(xì)胞增殖中作用機(jī)制的研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2011,21(20):2347

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(2013-09-27收稿 責(zé)任編輯姜春霞)

Effects of DZNep on proliferation, apoptosis and migration of Eca109 cells

1)CollegeofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)LaboratoryforCellBiology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

DZNep; Eca109 cell; proliferation; apoptosis; migration

Aim: To investigate the effect of DZNep on the proliferation, apoptosis and migration of Eca109 cells. Methods: DZNep was added to the medium of Eca109 cells and then incubated for 48 h, meanwhile, DMSO was used as control. The proliferation rate of Eca109 cells was examined by EdU method, the cell apoptosis rate was detected by flow cytometry assay, and cell migration rate was measured using Transwell assay. Results: Eca109 cells treated with DZNep had a lower cell proliferation rate [(34.60±4.45)%] than that of control group [(42.37±4.64)%](t=3.625，P=0.002). Eca109 cells treated with DZNep had a higher cell apoptosis rate [(16.27±3.70)%] than that of control group [(7.38±0.77)%](t=7.061，P<0.001). Eca109 cells treated with DZNep had a lower cell migration number [(179±38) cells] than that of control group [(494±99) cells](t=8.912，P<0.001). Conclusion: DZNep could inhibit the proliferative and migratory ability of Eca109 cells and promote its apoptotic ability.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.002

*國家自然科學(xué)基金資助項目 30700140；科技部國際科技合作基金資助項目 2007DFA01240

R735.1