HPLC法測定超微戊己丸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿含量

江星明??李榮東

[摘要] 目的 建立超微戊己丸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量測定方法。 方法 采用Kromasail C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相為流速1.0mL/min的乙腈-乙腈10%（50：50），測定波長為225nm。 結(jié)果 吳茱萸堿和吳茱萸次堿理論板數(shù)分別為2681和2067，Y吳茱萸堿=1.96 5×10-7X + 0.07646，r=0.9999）， Y吳茱萸次堿= 3.65 8×10-7X -0.2199，r=0.9999）， 吳茱萸堿與吳茱萸次堿的線性區(qū)間分別為10.2～51.0μg/mL以及10.0～50.0μg/mL ，兩者平均回收率分別為97.3%和101.4%，其相對標(biāo)準偏差分別為3.2%和3.9%，最低檢測限為0.05μg/mL和0.1μg/mL。 結(jié)論 使用高效液相色譜法對超微戊己丸當(dāng)中的吳茱萸堿以及吳茱萸次堿含量進行檢測的精確率較高，重現(xiàn)性好。

[關(guān)鍵詞] HPLC；吳茱萸堿；吳茱萸次堿

[中圖分類號] R286 [文獻標(biāo)識碼] B [文章編號] 2095-0616（2014）14-88-03

戊己丸屬于純中藥制劑，其處方組成為白芍（炒）、黃連各300g，吳茱萸（制）50g，臨床主要用于治療肝胃疾病、腹瀉腹痛、嘔吐胃酸，能夠達到泄肝火、調(diào)和脾胃的效果[1]。戊己丸的傳統(tǒng)測定方式是測定當(dāng)中鹽酸小檗堿的含量，首先用酸性甲醇索式和乙醇洗脫氧化鋁柱抽取和分解，最后利用紫外分光光度法獲得，但除此以外，吳茱萸堿同樣是藥方中的重要組成部分，但是在中國藥典及相關(guān)資料中對其測定方法的表述存在空白[2]。當(dāng)前出現(xiàn)的測定方式包括薄層掃描色譜法、高效液相色譜法等，而吳茱萸堿以及吳茱萸次堿含量的測定尚少見報道，本研究以高效液相色譜法測定超微戊己丸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量，取得了較好的效果，主要研究結(jié)果報道如下。

1 儀器與試劑

本次采用的高效液相色譜儀器型號為Agilent1260，紫外檢測器。戊己丸相關(guān)藥材均由省藥材公司提供，吳茱萸堿和吳茱萸次堿對照品均購于省藥檢所，以上涉及藥材均接受滿足中國藥典一部相關(guān)要求，流動相乙腈色譜純由匯虹試劑公司提供；所用試劑除甲醇、乙腈為色譜純外，其余為分析純，水為超純水[3]。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取吳茱萸堿1.5mg、吳茱萸次堿1.2mg，置于10mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，搖勻，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 取超微戊己丸1.3g于100mL錐型瓶中，加甲醇30mL，精密稱定后水浴加熱60min，放置使其溫度與室溫相同，精密稱定，補足損失的重量，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中定容，0.45μm微孔濾膜過濾，封存?zhèn)溆肹4]。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性實驗

KromasailC18分析色譜柱（250mm×4.6mm，微粒直徑5μm），流動相為流速1mL/min的乙腈-乙腈10%（50∶50），測定波長為225nm，柱溫為31℃。在以上條件下進行吳茱萸堿以及吳茱萸次堿對照品的檢測[5]。以上過程中吳茱萸堿保留時間為13.143min，吳茱萸堿理論塔板數(shù)為2681，吳茱萸次堿保留時間為16.025min，理論塔板數(shù)為2067，分離度大于1.5，對照品和供試品的HPLC圖見圖1。

圖1 吳茱萸堿和吳茱萸次堿混合對照品（A）與供試品（B）的HPLC圖

2.3 線性關(guān)系

精密選取適量的吳茱萸堿和吳茱萸次標(biāo)準液，進樣20μL，觀察色譜峰面積，以峰評價面積值X線性回歸濃度Y（μg/mL），計算得出：Y吳茱萸堿=1.965×10-7 X + 0.07646，r=0.9999），Y吳茱萸次堿=3.658×10-7X- 0.2199，r=0.9999），兩者對照品稀釋后依據(jù)最高值為基線噪音3倍計算[6]，最終得出吳茱萸堿和吳茱萸次堿的最低檢測限分別為0.05μg/mL和0.1μg/mL。

2.4 提取方式

將超微戊己丸細粉末其中1.3g精密測定后放置在100mL錐形瓶中，再置入25mL乙醇精密稱定，將20、40min時段超聲提取后精密稱定，補足失重，混勻，依照樣品測定項目下方式計算含量，根據(jù)以上步驟繼續(xù)取樣，水浴加熱選取20、40、60、90min，繼續(xù)精確稱定，補充消耗溶劑量，混勻，測定含量[7]。以60min加熱提取率100%做參照，可計算出吳茱萸次堿20min超聲提取率為63%，40min超聲提取率為66%。而20min吳茱萸堿水浴提取率為80%，40、90min水浴提取率分別為97%、101%，20、40、90min吳茱萸次堿水浴提取率為80%、97%、101%。以上數(shù)據(jù)顯示吳茱萸堿以及吳茱萸次堿水浴加熱60min時能夠完整提取。以上溶劑均為乙醇，水浴加熱60min時進行樣品提取。

2.5 精密度檢驗

先取1份吳茱萸對照溶液，試驗色譜與上述相同，5次反復(fù)進樣，觀察得知吳茱萸堿、吳茱萸次堿平均峰面積為1 360 407μg/mL、533 273μg/mL，相對標(biāo)準偏差為1.4%以及1.5%，結(jié)果表明儀器精密度良好[8]。

2.6 重復(fù)性試驗

每份為200mg一共選取4份吳茱萸粉末，與溶液制備方式相同處理，在液相色譜儀中加入10μg溶液，在相同的色譜條件下，測得吳茱萸堿相對標(biāo)準偏差為1.7%、吳茱萸次堿相對標(biāo)準偏差分別為1.5%，結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好[9]。

2.7 加樣回收率檢驗

得到超微戊己丸粉末樣品中吳茱萸堿以及吳茱萸次堿的含量后，繼續(xù)選擇5份粉末，精密加入各自量的100%到吳茱萸堿以及吳茱萸次堿當(dāng)中，然后測定制備5份回收樣品的含量，最終得到吳茱萸堿以及吳茱萸次堿的平均回收率分別為97.3%和101.4%，其相對標(biāo)準偏差分別為3.2%和3.9%。

3 結(jié)果

含量測量結(jié)果：將在液相色譜儀中加入對照品溶液和供試品溶液各20μL，記錄吳茱萸堿、吳茱萸次堿的色譜峰面積，計算最后結(jié)果。見表1。

表1 吳茱萸堿、吳茱萸次堿含量測量結(jié)果

批號 吳茱萸堿（mg/mL） 吳茱萸次堿（mg/mL）

011206 0.1759 0.2459

020110 0.1798 0.2577

020109 0.1837 0.2607

4 討論

高效液相色譜法又可稱為高壓液相色譜，由于其操作便利，靈敏度高，分離效果好，當(dāng)前已經(jīng)成為眾多領(lǐng)域尤其是中藥領(lǐng)域當(dāng)中最為重要的分離分析技術(shù)之一[10]。本研究戊己丸中的藥材吳茱萸又稱為茶辣、吳萸、米辣子、臭辣子樹、漆辣子、左力純幽子等，其來源于《本經(jīng)》[11]，其中記載“主溫中下氣，止痛，咳逆寒熱，除濕，血痹，逐風(fēng)邪，開腠理?！北静菥V目中則記載：“開郁化滯，治吞酸，厥陰痰涎頭痛，陰毒腹痛，疝氣血痢，喉舌口瘡[12]?！保兜揽酀?，對于患者能夠祛寒止痛、抑制嘔吐，同時陰虛火旺者不宜服用。臨床主要應(yīng)用在由陰濁上逆導(dǎo)致的頭疼以及胃痛當(dāng)中，同時對于肝胃虛寒也有較高的臨床應(yīng)用價值[13-14]。

本次測定首先確定了吳茱萸堿的最大吸收波長為225nm，當(dāng)波長超過230nm時其吸收曲線呈現(xiàn)明顯的下降，當(dāng)波長高于240nm時候強吸收消失；與吳茱萸堿相比，吳茱萸次堿的最高吸收波長以及次強吸收波長分別為345nm以及215nm，當(dāng)處于220～240nm時處于強吸收肩峰。由于本次要同時檢測吳茱萸堿和吳茱萸次堿，因此必須兼顧兩者的測定靈敏度，最終選擇以225nm進行測定的標(biāo)準波長。另外通過穩(wěn)定性試驗，發(fā)現(xiàn)樣品溶液的溫度應(yīng)該設(shè)置在18～22℃中，放入容量瓶中妥善保存，在10d內(nèi)能夠基本保證穩(wěn)定。從提取方式來看，將超微戊己丸碾磨至細粉狀，再用超聲法提取優(yōu)于常規(guī)回流提取法，選擇乙腈-乙腈10%（50∶50）作為流動相，分離效果較好。

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（收稿日期：2014-04-26）