補腎祛瘀化痰法對載脂蛋白E基因敲除小鼠認知功能的影響

姜 洋 楊惠民 占程燕 李 璐

(北京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院腦病三科，北京 100700)

補腎祛瘀化痰法對載脂蛋白E基因敲除小鼠認知功能的影響

姜 洋 楊惠民△占程燕 李 璐

(北京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院腦病三科，北京 100700)

目的通過研究補腎祛瘀化痰法對載脂蛋白E(ApoE)基因敲除小鼠認知功能的影響，探討其組方通脈益智膠囊對認知障礙的療效。方法將32只ApoE基因敲除小鼠隨機分為4組，即成年中藥組、老年中藥組、成年模型組及老年模型組，每組8只；將16只相同遺傳背景C57BL/6J小鼠隨機分為2組，即成年正常組及老年正常組，每組8只。成年組小鼠至24周起、老年組小鼠至32周起，中藥組以通脈益智膠囊灌胃12周，模型組與正常組以同容積0.9%氯化鈉注射液灌胃12周，均每日1次。24周及36周時，成年組小鼠予跳臺及避暗實驗；32周及44周時，老年組小鼠予跳臺及避暗實驗。結果在24周給藥前，成年中藥組、成年模型組與成年正常組小鼠的錯誤次數比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。記憶成績顯示，成年中藥組、成年模型組與成年正常組小鼠的錯誤次數均較第1 d有所減少，但比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；成年中藥組、成年模型組與成年正常組小鼠的潛伏時間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。表明在小鼠24周齡時未出現明顯認知障礙。在給藥12周后，成年中藥組、成年正常組錯誤次數均較成年模型組降低(P<0.05，P<0.01)，成年中藥組、成年正常組錯誤次數比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。記憶成績顯示，成年中藥組、成年正常組錯誤次數均較成年模型組降低(P<0.05，P<0.01)，潛伏時間均較成年模型組增加(P<0.05，P<0.01)；成年中藥組、成年正常組錯誤次數、潛伏時間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。表明在小鼠36周齡后已出現認知障礙，補腎祛痰化瘀法對認知障礙有一定改善。在32周給藥前，老年中藥組、老年模型組小鼠的錯誤次數均較老年正常組多(P<0.05)，老年中藥組與老年模型組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。第2 d的記憶成績顯示，老年中藥組、老年模型組小鼠的錯誤次數均較老年正常組多(P<0.05)，潛伏時間均較老年正常組減少(P<0.05)，老年中藥組小鼠的錯誤次數、潛伏時間與老年模型組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。表明32周齡時ApoE基因敲除小鼠已出現認知障礙。在給藥12周后(第44周)，老年中藥組、老年正常組的錯誤次數均老年模型組減少(P<0.05，P<0.01)，老年中藥組的錯誤次數與老年正常組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。記憶成績顯示，老年中藥組、老年模型組、老年正常組小鼠的錯誤次數均較前1 d有所減少，但比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；老年中藥組、老年正常組的錯誤次數均較老年模型組減少(P<0.01)，潛伏時間均增加(P<0.01)；老年中藥組的錯誤次數、潛伏時間與老年正常組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。表明在 44周齡時ApoE基因敲除小鼠已出現明顯的認知障礙，而補腎祛瘀化痰法則對認知障礙有明顯的改善作用。結論老年ApoE基因敲除小鼠存在認知功能損害；補腎祛瘀化痰法干預老年ApoE基因敲除小鼠后可改善行為學表現，進而改善認知功能。

小鼠，基因敲除；認知障礙，心理學；小鼠，轉基因

阿爾茲海默病(alzheimer's disease，AD)嚴重影響老年人的生活質量，并給家庭和社會帶來沉重負擔，隨著AD發(fā)病率逐年上升，尋求延緩或治療的方法被醫(yī)學界廣泛關注。一些研究證實脂質代謝障礙可能參與AD的發(fā)病機制[1-2]。載脂蛋白E(ApoE)在脂質代謝過程中發(fā)揮了重要作用，其參與維護膽固醇、磷脂的動態(tài)平衡，調節(jié)神經膜重塑時膽固醇與磷脂的動員與再分布，維護和修復神經元。近年來，ApoE基因成為AD的重要危險因素。ApoE基因敲除小鼠被廣泛應用于心腦血管疾病的動物模型，其因缺乏ApoE基因而出現脂質代謝障礙。有研究表明ApoE基因敲除小鼠在認知功能方面存在異常[3]。本實驗通過觀察補腎祛瘀化痰法對ApoE基因敲除小鼠認知功能的影響，為通脈益智膠囊治療血管性癡呆及動脈粥樣硬化的前期研究提供實驗基礎，為中醫(yī)治療認知功能障礙提供新的依據和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級8周齡ApoE基因敲除小鼠32只，均為雄性，體質量(20±2) g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號：SCXK(京)2011-0012；8周齡相同遺傳背景C57BL/6J小鼠16只，均為雄性，體質量(20±2) g，購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(軍)2007-004。飼養(yǎng)場地為北京中醫(yī)藥大學清潔級實驗動物房，普通飲食，充足攝食及飲水，室溫(25±2) ℃，風力0級，每日光照12 h，濕度25%～35%。

1.1.2 實驗藥物 通脈益智膠囊。藥物組成：女貞子、何首烏、丹參、赤芍藥、石菖蒲、遠志、漏蘆。將上述藥物水煎煮后濃縮干燥，粉碎過篩，混勻制成膠囊，由中日友好醫(yī)院試劑科提供，京藥制字Z20053786。

1.1.3 主要實驗儀器 YLS-17B 避暗穿梭測試儀、2H-100型跳臺試驗箱，均由北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院提供。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將32只ApoE基因敲除小鼠隨機分為4組，即成年中藥組、老年中藥組、成年模型組及老年模型組，每組8只；將16只相同遺傳背景C57BL/6J小鼠隨機分為2組，即成年正常組及老年正常組，每組8只。

1.2.2 給藥方法 成年組小鼠至24周起、老年組小鼠至32周起，中藥組以通脈益智膠囊750 mg/(kg·d)(劑量根據人與實驗動物用藥劑量換算得出)灌胃12周，模型組與正常組以同容積0.9%氯化鈉注射液灌胃12周，均每日1次。

1.2.3 實驗方法 24周及36周時，成年組小鼠予跳臺實驗及避暗實驗；32周及44周時，老年組小鼠予跳臺實驗及避暗實驗。

1.2.3.1 跳臺實驗 第1 d讓小鼠在箱內平臺上適應3 min，然后通電，記錄5 min內小鼠受到電擊的次數，即錯誤次數；第2 d重新測試，記錄5 min內小鼠第1次跳下平臺的時間(即潛伏期)、5 min內小鼠受到的電擊的總次數，5 min內小鼠未跳下平臺其潛伏期按300 s計算。

1.2.3.2 避暗實驗 本實驗利用小鼠喜暗厭明的習性，第1 d訓練前將小鼠頭背著洞口放入明室，先適應環(huán)境3 min，然后給暗室銅柵通以36 V電流，小鼠一進入暗室即受電擊，其正確反應是回到明室，銅柵通電持續(xù)5 min，此為訓練過程。第2 d對小鼠進行記憶測驗，記錄小鼠第1次進入暗室的時間(即避暗潛伏期)，并記錄5 min內小鼠進入暗室的次數(即避暗錯誤次數)，5 min內未進入暗室的小鼠其潛伏期按300 s計算。

2 結 果

2.1 成年組小鼠給藥前跳臺實驗及避暗實驗成績比較 見表1。

表1 成年組小鼠給藥前跳臺實驗及避暗實驗成績比較 ±s

由表1可見，在24周給藥前分別進行跳臺實驗及避暗實驗，第1 d為學習階段，第2 d重復測試為記憶階段。跳臺實驗和避暗實驗的學習成績顯示，成年中藥組、成年模型組與成年正常組小鼠的錯誤次數比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。記憶成績顯示，成年中藥組、成年模型組與成年正常組小鼠的錯誤次數均較第1 d有所減少，但比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；成年中藥組、成年模型組與成年正常組小鼠的潛伏時間均較第1 d降低，但比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。表明在小鼠24周齡時未出現明顯認知障礙。

2.2 成年組小鼠給藥后跳臺實驗及避暗實驗成績比較 見表2。

表2 成年組小鼠給藥后跳臺實驗及避暗實驗成績比較 ±s

與成年模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

由表2可見，在給藥12周后再進行跳臺實驗及避暗實驗，學習成績顯示，成年中藥組、成年正常組錯誤次數均較成年模型組降低(P<0.05，P<0.01)，成年中藥組、成年正常組錯誤次數比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。記憶成績顯示，成年中藥組、成年正常組錯誤次數均較成年模型組降低(P<0.05，P<0.01)，潛伏時間均較成年模型組增加(P<0.05，P<0.01)；成年中藥組、成年正常組錯誤次數、潛伏時間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。表明在小鼠36周齡后已出現認知障礙，補腎祛痰化瘀法對認知障礙有一定改善。

2.3 老年組小鼠給藥前跳臺實驗及避暗實驗成績比較 見表3。

表3 老年組小鼠給藥前跳臺實驗及避暗實驗成績比較 ±s

與老年正常組比較，*P<0.05

由表3可見，在32周給藥前分別進行跳臺實驗及避暗實驗，第1 d的學習成績顯示，老年中藥組、老年模型組小鼠的錯誤次數均較老年正常組多(P<0.05)，老年中藥組與老年模型組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。第2 d的記憶成績顯示，老年中藥組、老年模型組小鼠的錯誤次數均較老年正常組多(P<0.05)，潛伏時間均較老年正常組減少(P<0.05)，老年中藥組小鼠的錯誤次數、潛伏時間與老年模型組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。表明32周齡時ApoE基因敲除小鼠已出現認知障礙。

2.4 老年組小鼠給藥后跳臺實驗及避暗實驗成績比較 見表4。

表4 老年組小鼠給藥后跳臺實驗及避暗實驗成績比較 ±s

與老年模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

由表4可見，在給藥12周后(第44周)再進行跳臺實驗及避暗實驗，學習成績顯示，老年中藥組、老年正常組的錯誤次數均老年模型組減少(P<0.05，P<0.01)，老年中藥組的錯誤次數與老年正常組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。記憶成績顯示，老年中藥組、老年模型組、老年正常組小鼠的錯誤次數均較前1 d有所減少，但比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；老年中藥組、老年正常組的錯誤次數均較老年模型組減少(P<0.01)，潛伏時間均增加(P<0.01)；老年中藥組的錯誤次數、潛伏時間與老年正常組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。表明在 44周齡時ApoE基因敲除小鼠已出現明顯的認知障礙，而補腎祛瘀化瘀法則對認知障礙有明顯的改善作用。

3 討 論

中醫(yī)學認為，AD屬癡呆范疇，其病位在心和腦，屬虛實夾雜之證，病機主要有腎精虧虛、髓海失充而導致腦失所養(yǎng)，或由肝郁脾濕、痰阻血瘀造成腦脈痹阻。治以補腎填精、益智開竅、滌痰化瘀為大法，佐以益氣健脾、養(yǎng)血柔肝、通絡開痹之品。通脈益智膠囊中女貞子、何首烏補肝益腎，填精充髓，有滋陰強壯之力，為君藥；丹參、赤芍藥活血化瘀，為臣藥；石菖蒲、遠志芳香化濁，祛痰利竅，為佐藥；使以漏蘆清熱通竅疏經。諸藥合用，共奏補肝益腎、化瘀祛痰、益智醒神之功。

ApoE基因在中樞神經系統(tǒng)中由星形膠質細胞合成并分泌，可調節(jié)神經膜重塑時膽固醇與磷脂的動員與再分布，維護和修復神經元。有研究發(fā)現[4]，ApoE基因可能與記憶呈相關性。ApoE基因敲除小鼠的血腦屏障的通透性是普通小鼠的3.7倍，這就導致一些非必需小分子化合物進入大腦，造成大腦功能的部分紊亂，從而可能引發(fā)老年癡呆[5]。賈雪梅等[6]發(fā)現，載脂蛋白E敲除小鼠海馬神經元內β-淀粉樣蛋白的表達高于C57BL/6J小鼠，與ApoE基因異常導致AD等神經退行性疾病的認知功能障礙可能有著密切聯系。ApoE基因敲除小鼠一直被用于動脈粥樣硬化的研究，由于其認知功能的異常，故近期亦被用于認知障礙的研究。

本實驗中所采取的跳臺實驗及避暗實驗均是檢測結果比較明顯的行為學實驗，根據實驗小鼠對電流刺激的記憶及學習能力來評價受試動物神經行為學在用藥前后、組別之間的差異。由于跳臺實驗及避暗實驗的操作性較強及靈敏度較高，故在各種小鼠的神經行為學檢測中應用較廣。本實驗研究結果顯示，在24周時，給藥前各組并無明顯異常，可能由于ApoE 基因敲除小鼠的認知功能損害在24周時并未出現，但當給藥12周后，即成年組小鼠為36周齡時，認知功能損害已經顯現，模型組小鼠在行為學表現方面明顯差于中藥組及正常組。而老年組ApoE基因敲除小鼠32周齡時在未給藥的情況下，在跳臺實驗及避暗實驗中的第1 d錯誤次數、第2 d錯誤次數及第2 d潛伏時間與正常組C57BL/6J小鼠比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，由此可推測32周齡的ApoE基因敲除小鼠比C57BL/6J小鼠的認知功能有所減低；給藥12周至44周齡時，模型組與中藥組、正常組在認知功能方面存在明顯差異。老年中藥組在給予通脈益智膠囊12周后進行跳臺實驗及避暗實驗，在各個指標方面均優(yōu)于同周齡模型組小鼠，并且與同周齡C57BL/6J小鼠比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結合成年組及老年組不同周齡小鼠的行為學表現可知，通脈益智膠囊針對認知障礙有效，而且在前期研究中，通脈益智膠囊針對血管性癡呆[7]、動脈粥樣硬化[8]及高脂血癥等均有較好療效。

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(本文編輯：習 沙)

EffectsoftheprescriptionfortonifyingkidneyandremovingstasisandreducingphlegmoncognitivefunctionofApoEknockoutmice

JIANGYang，YANGHuimin，ZHANChengyan，etal.

EncephalopathyDepartmentThree，FirstClinicalCollegeAffiliatedtoBeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine，Beijing100070

ObjectiveTo explore the effects of the prescription (Tongmai Yizhi capsule) for tonifying kidney and removing stasis and reducing phlegm on cognitive function of ApoE knockout mice.Methods32 ApoE knockout mice were randomly divided into four groups，the treatment group and model group of senior and the treatment group and model group of elder，8 mice in each group.And 16 C57BL/6J mice were divided into two groups as the normal groups in senior and elder 8 mice in each group.Mice in treatment group of senior

Tongmai Yizhi capsule from 24 weeks of mice for 12 weeks.Mice in treatment group of elder received Tongmai Yizhi capsule from 32 weeks of mice for 12 weeks.Mice in model group and the normal group received the same volume of 0.9% sodium chloride injection for 12 weeks.At 24 weeks and 36 weeks，jumping and to avoid dark experiment of mice in group of senior were finished.At 32 weeks and 44 weeks，jumping and to avoid dark experiment of mice in group of elder were finished.ResultsThere was no difference between the treatment group，model group and normal group in senior on the number of errors before treatment (P<0.05).After continuous infusion 12 weeks，there were differences between the treatment group，model group and normal group in senior on the number of errors in memory performance (P<0.05，P<0.01).The the number of errors in memory performance in the treatment group and normal group in senior were lower than that in model group in senior.Latent time was increased as compared with that in model group (P<0.05，P<0.01).There was no difference between treatment group and normal group on the the number of errors and latent time (P>0.05).The results showed that ApoE knockout mice at 36-weeks had cognitive impairment.The method of tonifying kidney and removing stasis and reducing phlegm can improve cognitive impairment.Before 32-weeks the number of errors in model group and treatment group in elder were more than that in normal group in elder (P<0.05).There was no difference between model group and treatment group in elder on the number of errors (P>0.05).After continuous infusion 12 weeks， The number of errors in memory performance in the treatment group and normal group in elder were lower than that in model group in senior (P<0.05).Latent time was increased as compared with that in model group (P<0.05，P<0.01).The results showed that ApoE knockout mice at 44-weeks had cognitive impairment.The method of tonifying kidney and removing stasis and reducing phlegm can improve cognitive impairment.ConclusionApoE knockout mice have cognitive impairment when they get old.The method of tonifying kidney and removing stasis and reducing phlegm can improve neurobehavioral manifestation and cognitive impairment on ApoE knockout mice.

Mice，Gene knockout；Cognitive disorders；Psychology；Transgenosis

△ 通訊作者：北京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院腦病三科，北京 100700

姜洋(1986—)，女，博士研究生在讀，碩士。研究方向：老年病及神經內科學。

R245.97；R341；R395；R741

A

1002-2619(2014)03-0428-05

2013-07-03)