吡柔比星在骨肉瘤細胞放射增敏中的作用研究

許新明 王莉 劉明 徐袁秋

·論著·

吡柔比星在骨肉瘤細胞放射增敏中的作用研究

許新明 王莉 劉明 徐袁秋

目的 研究吡柔比星在骨肉瘤細胞MG-63的放射增敏中的作用。方法用MTT法檢測不同濃度吡柔比星對對數(shù)生長期的MG-63細胞的抑制作用，確定IC10的數(shù)值，作為實驗的藥物濃度。用克隆形成分析法測定MG-63細胞在IC10濃度吡柔比星作用24 h后給予不同劑量(0、2、4、6、8Gy)照射以及IC10濃度紫杉醇作用不同時間(12、24、36 h)后給予一定劑量射線照射的存活分數(shù)(SF)，擬合細胞生存曲線并計算放射增敏比，分析吡柔比星作用于MG-63細胞不同時間(12、24、36 h)后細胞生存率的變化。結(jié)果不同濃度吡柔比星作用24 h后，MG-63細胞抑制率逐漸增高(P<0.01)，其藥物毒性呈濃度依賴性，IC10為0.004 μg/ml。IC10濃度吡柔比星増敏比分別1.49(D0比)、1.06(Dq比)和1.04(SF2比)，MG-63細胞α/β值為2.23，IC10濃度吡柔比星作用后為0.27。IC10濃度吡柔比星作用于MG-63細胞不同時間后再進行照射，細胞存活分數(shù)隨時間延長逐漸降低(P<0.01)。結(jié)論吡柔比星對MG-63細胞有放射增敏作用，在一定時間內(nèi)與藥物作用時間呈正相關。

吡柔比星；骨肉瘤；放射增敏

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是最常見的原發(fā)骨腫瘤，主要發(fā)病于青少年[1]，5年生存率為70%左右，治療方法主要為手術(shù)和化療[2]。但是有約20%患者骨肉瘤生長在脊柱、骨盆等手術(shù)不易切除的部位[1]。對于這些患者，放射治療顯得尤為必要。吡柔比星是治療腫瘤的一種常見藥物，廣泛用于惡性淋巴瘤、乳腺癌、膀胱癌等多種腫瘤的治療中[3,4]，對骨肉瘤的治療亦有較好的療效[5]。本研究主要目的即觀察吡柔比星對骨肉瘤細胞的放射增敏效果及其與藥物作用時間的關系，以期為臨床應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 細胞株、藥物和試劑 本研究所用骨肉瘤細胞株MG-63由河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院實驗中心提供，為單層貼壁生長；吡柔比星由浙江海正藥業(yè)公司生產(chǎn)(生產(chǎn)批號：121201)；DMEM和胎牛血清購自HyClone公司；噻唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)由購自Solarbio公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 采用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置于含5%CO2、37℃恒溫的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，0.25%胰酶消化、傳代，取對數(shù)生長的細胞進行實驗。

1.3 照射條件及方法 采用直線加速器(Varian IX)產(chǎn)生的6 MV X線進行照射，劑量率為300 cGy/min，細胞面覆蓋硅膠與放射源距離為100 cm，室溫下照射。

1.4 實驗方法

1.4.1 MTT實驗：將對數(shù)生長期的細胞用胰酶消化后調(diào)整細胞密度至3×104/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每組6個復孔，每孔100 μl，培養(yǎng)12～16 h至細胞貼壁，將吡柔比星按比例稀釋加入96孔板，同時設對照組及調(diào)零孔。置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后每孔加入新鮮配制的MTT(5 mg/ml)15 μl，再次孵育4 h，棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μl，震蕩10 min，于酶標儀上測定各孔吸光度(測定波長520 nm)并計算IC10。實驗重復3遍。細胞抑制率=(1-A加藥/A對照)×100%。

1.4.2 克隆形成分析實驗：將細胞常規(guī)消化后分別按不同照射劑量以不同密度接種于6孔板，培養(yǎng)12～16 h至貼壁，按分組要求加入藥物、進行照射，照射完成后于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)10～14 d，取出培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2遍，無水乙醇固定15 min，去除固定液，結(jié)晶紫色30 min，對含50個細胞以上的克隆進行計數(shù)，計算克隆形成率及細胞存活分數(shù)?？寺⌒纬陕?PE)=克隆數(shù)/接種的細胞數(shù)，細胞的存活分數(shù)(SF)=處理細胞克隆形成率(PE處)/對照細胞克隆形成率(PE對)。

1.5 實驗內(nèi)容及分組

1.5.1 細胞生長抑制實驗：采用MTT法進行檢測不同濃度藥物對MG-63細胞的生長抑制作用。按藥物濃度不同分為7組，分別為：0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10和100 μg/ml，同時設對照組。

1.5.2 采用克隆形成分析法測定藥物放射增敏性：根據(jù)前期MTT法測的結(jié)果，以IC10(0.004 μg/ml)作為吡柔比星實驗濃度，實驗分為單純照射組(照射劑量分別為0、2、4、6和8 Gy)和藥物作用24 h后照射組(照射劑量同單純照射組)。

1.5.3 采用克隆形成分析法測定最佳照射時間：將接種好的細胞分為對照組、吡柔比星12 h+照射組、吡柔比星24 h+照射組、吡柔比星36 h+照射組，吡柔比星濃度為0.004 μg/ml，照射劑量為4 Gy。

1.6 統(tǒng)計學分析 多組間比較采用單因素方差分析進行統(tǒng)計；細胞存活曲線采用多靶單擊數(shù)學模型SF=1-(1-e(-D/D0))N進行擬合，Dq=D0·lnN，求出平均致死劑量(D0)、準閾劑量(Dq)和照射劑量為2Gy的存活分數(shù)(SF2)，根據(jù)曲線參數(shù)計算增敏比(SER)，SER分別用D0比、Dq比和SF2比表示(D0比=單照射D0/處理D0，Dq比=單照射Dq/處理Dq，SF2比=單照射SF2/處理SF2)；采用SPSS 13.0及Origin Pro 8.5軟件，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測不同濃度吡柔比星對MG-63細胞的生長抑制作用 采用不同濃度吡柔比星作用24 h后MG-63細胞存活情況可見，隨著吡柔比星濃度的增高，細胞生長抑制率增加(F=202.60，P<0.01)，當藥物濃度達到100 μg/ml時，其增殖抑制率達到88.49%，顯示出較強的增殖抑制作用。其藥物毒性呈濃度依賴性，IC10為0.004 μg/ml。見表1、圖1。

濃度(μg/ml)吸光度細胞抑制率(%)對照組0．60±0．09—0．00010．57±0．116．5±3．90．0010．56±0．117．0±6．30．010．56±0．116．7±5．40．10．44±0．0926．0±6．410．32±0．0747．2±3．3100．09±0．0184．7±0．51000．07±0．0288．5±1．3

圖1 不同濃度吡柔比星對MG-63細胞的生長抑制作用

2.2 吡柔比星對MG-63細胞的放射增敏作用 IC10濃度吡柔比星作用于MG-63細胞24 h后聯(lián)合不同劑量X線照射，細胞存活曲線圖可見，通過分析多靶單擊模型表明：單純照射D0、Dq和SF2值分別為2.51Gy、2.42Gy、0.79，吡柔比星作用24 h后照射D0、Dq和SF2值分別為1.69Gy、2.29Gy、0.76，増敏比為1.49(D0比)、1.06(Dq比)、1.04(SF2比)，表明吡柔比星對MG-63細胞有一定的增敏作用，且高劑量照射增敏效果佳。線性二次模型的結(jié)果顯示：骨肉瘤的α、β和α/β值分別為0.067、0.030和2.23，吡柔比星作用后α、β和α/β值分別為0.017、 0.064和0.27。α/β值較吡柔比星作用前減小。見圖2、3。

圖2 吡柔比星對MG-63細胞放射敏感性的影響(多靶單擊模型)

圖3 吡柔比星對MG-63細胞放射敏感性的影響(線性二次模型)

2.3 吡柔比星作用后最佳照射時間 吡柔比星加照射組與單純照射組比較，細胞存活分數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且吡柔比星作用不同時間后照射組間比較差異有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，吡柔比星對MG-63細胞作用36 h后照射細胞存活分數(shù)最低，表明吡柔比星對MG-63細胞的放射增敏效果與藥物作用時間呈正相關性(r=0.962，P<0.05)。見表2。

組別存活分數(shù)單純照射12．86±1．07吡柔比星12h+照射組5．67±0．44?吡柔比星24h+照射組3．37±0．31?#吡柔比星36h+照射組0．52±0．08?#△

注：與單純照射組比較，*P<0.05；與吡柔比較12 h+照射組比較，#P<0.05；與吡柔比星24 h+照射組比較，△P<0.05

3 討論

多年來隨著多種化療藥物相繼應用于骨肉瘤的治療，骨肉瘤的生存率逐漸提高達到70%左右[6]。目前治療骨肉瘤的化療方案以阿霉素、順鉑、大劑量甲氨蝶呤、異環(huán)磷酰胺等多藥聯(lián)合化療為主。但是大劑量聯(lián)合化療帶來的不良反應也受到人們的重視，Bacci等[7]對無轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者進行長期隨訪發(fā)現(xiàn)阿霉素造成的心臟毒性和男性不育是化療的兩個主要并發(fā)癥。相對于阿霉素而言，吡柔比星的心臟毒性則明顯較輕。吡柔比星是1979年由日本微生物化學研究所梅澤濱夫(H.Umezawa)等研制開發(fā)的新一代蒽環(huán)類廣譜抗腫瘤抗生素，其化學結(jié)構(gòu)與多柔比星相近，是多柔比星氨基糖部分第4’位OH基上的一個異構(gòu)體。對癌細胞的作用機制主要是進入細胞內(nèi)，迅速分布于細胞核，抑制DNA聚合酶α和β，阻礙核酸的合成。藥物嵌入DNA的雙螺旋鏈，使腫瘤細胞終止在G2期，不能進行到細胞分裂期，導致腫瘤細胞死亡。Shinozaki等[8]研究表明以吡柔比星為基礎的化療方案比以阿霉素為基礎的化療方案更具優(yōu)勢，對于復發(fā)和轉(zhuǎn)移的骨肉瘤吡柔比星也有較好的療效[9,10]，故吡柔比星常用于骨肉瘤的化療。

放射治療是治療惡性腫瘤的另一有效手段，一般認為骨肉瘤對于放療不敏感，但是對于某些特殊部位不能手術(shù)或手術(shù)無法徹底切除或切緣陽性及誘導化療組織學反應不佳的患者，放射治療則不可缺少。術(shù)前放療可提高截肢術(shù)的成功率，減少腫瘤復發(fā)的風險。Anacak等[11]把手術(shù)植骨與體外放療相結(jié)合，在22個月的隨訪期內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)局部復發(fā)和手術(shù)失敗，取得了很好的療效。

隨著多種放射增敏藥物的發(fā)現(xiàn)，多種對放射線不敏感的腫瘤得以獲得更好的治療，目前對吡柔比星在骨肉瘤放射治療中的作用研究報道較少。本研究在吡柔比星作用于骨肉瘤細胞24 h后對瘤細胞進行不同劑量照射，發(fā)現(xiàn)増敏比均>1，表明吡柔比星對骨肉瘤細胞亦有較好的放射增敏作用。分析原因可能為：(1)吡柔比星聯(lián)合放射使MG-63細胞存活曲線肩區(qū)變窄，Dq值變小，在多靶單擊模型中Dq變小意味著亞致死損傷修復減少。(2)吡柔比星可將細胞阻滯于G2期，而在細胞周期中由于處于G2/M期的細胞對放射線最敏感，從而促進瘤細胞凋亡，表現(xiàn)出放射增敏作用。本研究同時顯示吡柔比星作用于MG-63細胞不同時間后，細胞存活分數(shù)逐漸減小，表明吡柔比星的放射增敏作用與作用于腫瘤細胞的時間有關，其機制可能為吡柔比星對細胞周期(主要是G2/M期)阻滯的積累作用增加了腫瘤細胞的放射敏感性。任振泰等[12]研究多西紫杉醇對A549細胞的放射增敏作用發(fā)現(xiàn)藥物作用24 h后進行X線照射細胞存活分數(shù)最低，其后時間延長細胞存活分數(shù)則增高。本實驗未進行更多分組，吡柔比星作用延長更多時間后細胞存活分數(shù)是否會更小有待進一步研究。研究結(jié)果提示，在臨床中實施骨肉瘤的治療方案時，吡柔比星與放療序貫結(jié)合可能會使藥物在殺傷腫瘤細胞的同時提高放其放射敏感性，進而獲得更好的療效。另外研究表明單次大劑量(>2 Gy)的照射較單次劑量2 Gy的常規(guī)照射增敏效果更好，提示臨床中可采用大分割放療。另外，本研究發(fā)現(xiàn)藥物作用后線性二次模型α/β值變化較大，提示在同步放化療時吡柔比星化療方案結(jié)束后需注意及時調(diào)整放療劑量及方案，以達到準確的生物有效劑量。

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·消 息·

雜志稿件內(nèi)容的有關規(guī)范要求

1.當報告以人為研究對象的試驗時，作者應該說明其遵循的程度是否符合負責人體試驗的委員會(單位性的、地區(qū)性的或國家性的)所制定的倫理學標準并得到該委員會的批準，是否取得受試對象的知情同意。

2.根據(jù)GB/T 7408-94《數(shù)據(jù)元和交換格式 信息交換 日期和時間表示法》，由特定起點與終點定界的時間段的表示，起點與終點之間以一字線為分隔符，而不再用波紋線。示例如下：2001—2004年，而不再表示為2001～2004年，但“—”也可以用“至”取代。注意：除了上述時間段之外的其他計數(shù)、計量范圍的表示，仍然用“～”，如2～8 kg。

3.根據(jù)人民衛(wèi)生出版社出版的全國高等學校教材《衛(wèi)生統(tǒng)計學》第5版，報告統(tǒng)計學檢驗的結(jié)論時，對P值小于或等于檢驗標準(一般為0.05)的情況，一律描述為“差異有統(tǒng)計學意義”，同時寫明P值的具體數(shù)值或相應的不等式，不再采用將P<0.05描述為“差異有顯著意義(或差異有顯著性)”、將P<0.01描述為“差異有非常顯著意義(或差異有非常顯著性)”的表達方法。在用不等式表示P值的情況下，一般選用P>0.05、P<0.05和P<0.01三種表達方式即可滿足需要，無須再細分為P<0.001或P<0.0001。

4.為便于表格的排版和版式的美觀，表格中注釋用的角碼符號一律采用單個角碼的形式，按下列順序選用：*、#、△、☆、▲、★；在表注中依先縱后橫的順序依次標出。

本刊編輯部

Studyontheeffectofpirarubicininradiosensitizationofosteosarcomacellsinvitro

XUXinming,WANGLi,LIUMing,etal.DepartmentofRadiotherapy,TheThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050051,China

ObjectiveTo investigate the effect of pirarubicin in radiosensitization of human osteosarcoma cells (MG-63) in vitro.MethodsMTT was used to measure the inhibitory effect of pirarubicin on MG-63cells at exponential growth phase to determine IC10 as drug concentration of experiment.After MG-63 were treated with IC10 concentration pirarubicin for 24 hours,the cells were given different doses (0,2,4,6,8Gy) of irradiation as well as IC10 concentration paclitaxel for different time points (12h,24h,36h),finally the cell survival fraction (SF) was detected by clone formation analysis method,radiosensitization ratio was calculated by fitting cell survival curve,and the changes of cell survival rate of MG-63 treated by pirarubicin in different time points (12h,24h,36 h) were analyzed.ResultsAfter 24-hour pirarubicin administration,the cell inhibition rate was gradually increased (P<0.01),and the drug toxicity was dose-dependent,with IC10 concentration being 0.004μg/ml.According to D0,Dq and SF2 value,the sensitivity enhancement ratio (SER) of IC10 concentration pirarubicin was 1.49,1.06 and 1.04,respectively,theα/β ratio of MG-63 cells was 2.23,after treated with IC10 concentration pirarubicin,which was 0.27.After treated with IC10 concentration pirarubicin,MG-63 cells

irradiation.The cell survival fraction was gradually decreased with the time prolongation (P<0.01).ConclusionPirarubicin has radiosensitizing effect on MG-63 cells,and the effect is positively correlated to effect time of drug within a certain time.

pirarubicin；osteosarcoma；radiosensitization

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.02.004

項目來源：河北省醫(yī)學科學重點研究課題(編號：20120095)

050051 石家莊市，河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院放療科

徐袁秋，050051 河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院放射科；

E-mail：yuanqiuxqian@hotmail.com

R 730.55

A

1002-7386(2014)02-0173-04

2013-07-23)