紫外分光光度法檢測血液診斷佐匹克隆中毒的方法

白云 陳興 杜書明 范川鵬

·藥物研究·

紫外分光光度法檢測血液診斷佐匹克隆中毒的方法

白云 陳興 杜書明 范川鵬

目的 探討建立血清中佐匹克隆定性、定量的紫外分光光度法測定，為臨床佐匹克隆中毒提供診療依據(jù)。方法取0.5 ml血清加0.5 mol/L鹽酸0.1 ml混勻，再加10%高氯酸甲醇溶液0.1 ml沉淀蛋白，充分震蕩混勻，置-18℃冰箱冷凍10 min，以12 000 r/min高速離心，取上清液50 L于微量比色池中紫外掃描。結(jié)果血清中佐匹克隆最大吸收峰(310±1)nm，濃度在3.0～30.0 g/ml范圍內(nèi)呈線性，回歸方程y=0.0158x+0.0052，其相關系數(shù)為0.9995,方法回收率為86.8%～102.8%；相對標準差(RSD%)為3.3%～4.8%。日內(nèi)、日間RSD%分別為2.45%～4.78%和2.75～4.81%，最低檢出濃度：2.0 g/ml。結(jié)論該方法操作簡便、分析快速，結(jié)果準確，為臨床診斷佐匹克隆中毒提供了一個簡便準確的檢測方法。

血液；佐匹克隆；紫外掃描；定性；定量

佐匹克隆(zopiclone)為環(huán)吡咯酮類第三代鎮(zhèn)靜催眠藥，是國內(nèi)外近年來用于臨床的一種新藥。隨著這一新型藥物在臨床上的應用，出現(xiàn)誤服、自殺或投毒的案件呈上升趨勢，遇到中毒昏迷的患者，臨床醫(yī)生迫切需要了解中毒安眠藥物的類型，以求對癥治療。我們參考有關文獻[1-5]探討了中毒患者血液中佐匹克隆成分定性、定量的紫外分光光度法。該方法提取過程簡單、儀器相對價廉，且具有快速、準確、靈敏的優(yōu)點，在臨床應用中取得了滿意結(jié)果。

1 儀器與方法

1.1 儀器與試劑 UV-2600雙光速紫外/可見分光光度計，50 L微量比色池(上海天美科學儀器有限公司)；LG16-B高速離心機(北京雷勃爾離心機有限公司)；冰箱；電熱恒溫水箱；SK-1型快速混勻器(常州國華電器有限公司)。佐匹克隆標準品，純度為99.0%(天津市藥品研究所提供)，高氯酸、甲醇、鹽酸為分析純；帶蓋的5.0 ml塑料試管；健康人混合血清，佐匹克隆中毒患者血清來源于醫(yī)院急診科。

1.2 工作曲線的繪制 準確配制0.1 mol/L鹽酸溶液，用0.1 mol/L鹽酸溶液配制100 g/ml的佐匹克隆標準貯備液。取配制好的100 g/ml的佐匹克隆標準貯備液，用健康人混合血清逐級稀釋為30.0、20.0、10.0、5.0、1.0、0.5、0.00 g/ml的佐匹克隆工作應用液，分別取0.5 ml于7個帶蓋的容積5.0 ml塑料試管中(最后一管不含佐匹克隆，作為空白管)。加0.5 mol/L鹽酸溶液0.1 ml，然后各加10%高氯酸甲醇溶液0.1 ml沉淀蛋白，于SK-1型快速混勻器混勻后，置于冰箱-18℃冰凍10 min，室溫融化，然后以12 000 r/min高速離心5 min，取上清液備用。設定掃描波長范圍為200～400 nm。取空白管上清液50 L做基線測量，然后掃描不同濃度的佐匹克隆標準上清液，佐匹克隆最大吸收峰在(310±1)nm。見圖2。按上述操作方法做5次平行試驗，根據(jù)在(310±1)nm測定的平均吸光度值(y)并對佐匹克隆質(zhì)量濃度(x)進行回歸，得線性回歸方程y=0.0158x+0.0052，相關系數(shù)r=0.9996,線性范圍為3.0～30 g/ml，本法測定佐匹克隆最低檢出濃度為2.0 g/ml。

1.3 樣品測定 取帶蓋塑料試管標注V(患者)和B(空白)，V管加患者血清或血漿0.5 ml，B管加健康人混合血清0.5 ml，加0.5 mol/L鹽酸溶液0.1 ml酸化血清，然后各加10%高氯酸甲醇溶液0.1 ml沉淀蛋白，于SK-1型快速混勻器混勻后，置于冰箱-18℃冰凍10 min，室溫融化，然后以12 000 r/min高速離心5 min，取上清液備用。設定掃描波長范圍為200～400 nm。取空白管B上清液50 L做基線測量，然后掃描待測樣品V管。根據(jù)(310±1)nm處的最大吸收峰進行定性，查標準曲線或回歸方程求出患者血清中佐匹克隆含量。

1.4 血清空白試驗 取健康人混合血清0.5 ml分別加入3個帶蓋的塑料試管中，按前述樣品處理及試驗方法，用其中一份上清液50 L做基線測量，然后再掃描其它兩份空白上清液。見圖3?？瞻讓嶒灡砻鳎涸撛囼灧椒ㄒ坏┰?310±1)nm出現(xiàn)最大吸收峰，結(jié)合臨床，應考慮血清中有佐匹克隆成分的存在。

2 結(jié)果與討論

2.1 佐匹克隆檢測的最大吸收峰 用0.1 mol/L鹽酸溶液配制100 g/ml的佐匹克隆標準貯備液。然后再用0.1 mol/L鹽酸稀釋佐匹克隆貯備液，使其佐匹克隆濃度為30、20、10 g/ml的標準應用液。以0.1 mol/L鹽酸為空白做基線測量，分別對佐匹克隆標準應用液進行掃描。結(jié)果佐匹克隆在(303±1)nm處有最大吸收峰。見圖1。因此確定(303±1)nm為佐匹克隆片劑檢測波長，與有關文獻報道相符[1-3]。

2.2 血液中佐匹克隆紫外測定方法的建立 本文參考有關文獻[4-9]建立了紫外分光光度法對血中佐匹克隆的定性定量測定，方法見樣品測定部分?；颊哐寤蜓獫{中加入0.5 mol/L鹽酸，目的是增加佐匹克隆在血清中的溶解度；加10%高氯酸甲醇溶液，目的是沉淀血清蛋白；高速離心可以使上清液無雜質(zhì)。血清樣品中佐匹克隆最大吸收峰出現(xiàn)在(310±1)nm。見圖2。比佐匹克隆標準品最大吸收峰(303±1)nm波長略有“紅移”，考慮是佐匹克隆可變異的助色基團溶解在10%高氯酸甲醇溶液中使吸收光譜的位置發(fā)生了變化，即“紅移”。所以測定血清中佐匹克隆應根據(jù)(310±1)nm的最大吸收峰進行定性，查工作曲線或回歸方程求患者血清中佐匹克隆含量，患者胃液佐匹克隆測定最大吸收峰為(303±1)nm。

圖1 稀鹽酸中佐匹克隆標準吸收光譜(303±1)nm

圖2 血清中佐匹克隆吸收光譜(310±1)nm

圖3 空白血清吸收光譜

2.3 精密度試驗 取健康人混合血清20.0 ml，分別配制0.00、5.0、10.0、15.0 g/ml高、中、低三種佐匹克隆濃度血清樣品，分別取其0.5 ml于4個帶蓋的容積5.0 ml塑料試管中。其他操作按樣品測定進行。取空白管上清液50 L做基線測量，然后再掃描不同濃度的佐匹克隆血清樣品。在同一日不同時間及不同日間按上述方法測定佐匹克隆濃度，計算日內(nèi)日間相對偏差。見表1。

表1 方法精密度試驗結(jié)果 n=5，%

2.4 方法回收率試驗 取健康人混合血清20.0 ml，分別配制0.00、0.50、5.0、10.0 g/ml的佐匹克隆血清樣品，分別取其0.5 ml于4個帶蓋的容積5.0 ml塑料試管中。其它操作按“樣品測定”進行。取空白管上清液50 L做基線測量，然后再掃描不同濃度的佐匹克隆血清樣品。在相同條件下測定佐匹克隆濃度(n=5)。其回收率分別為86.8%、102.8%和96.5%；相對標準差(RSD%)分別為：4.8%、3.3%和4.7%。

2.5 干擾試驗 取健康人混合血清10.0 ml，配置分別含有安定、多慮平、艾司唑侖、氯氮平和氯美扎酮(5 g/ml)的佐匹克隆標準應用液(5.0 g/ml)。根據(jù)樣品測定部分操作。結(jié)果表明安定、多慮平、氯氮平和氯美扎酮常見鎮(zhèn)靜類藥物對佐匹克隆無干擾。

對于藥物中毒的診斷與搶救，既要準確及時，又要對癥救治，而紫外分光光度法分析藥物是比較簡便快速的，并且可以降低有機物的污染。本文探討了中毒患者血液中佐匹克隆成分定性、定量的紫外分光光度法，該方法提取過程簡單、不需要有機溶劑萃取，儀器相對價廉，且具有準確、靈敏的特點。血液中佐匹克隆在310 nm有最大吸收峰，胃液中佐匹克隆最大吸收峰為(303±1)nm?？捎糜谧羝タ寺≈卸镜脑\斷。

1 呂露陽，代麗萍，謝玲玲，等.紫外分光光度法測定右佐匹克隆片的含量.西南民族大學學報，2011，37：636-637.

2 劉惠軍，吳麗紅.佐匹克隆原料及片劑有關物質(zhì)的HPLC測定.中國藥學雜志，2008，43：954-956.

3 王鐵杰，李玉蘭，王玉.HPLC法測定佐匹克隆片含量及含量均勻度.中國藥品標準，2003，4：54-55.

4 陳姿如，陳禮明，杜書明，等.血清中佐匹克隆氣相色譜法測定.中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2012，30：314-315.

5 楊麗君.反相高效液相色譜法測定血清中的佐匹克隆.色譜，2002，3：256-258.

6 Le Liboux A，F(xiàn)rydman A，Gaillot J.Simutaneous deterinination of zopiclone and its two major metabolites Cn-Oxide and (N-desmethyl) in human biological fluidsby reversed-phase high-performance liquid chromatojraphy.Jchromatogr，1987,417:151.

7 李煥德，許樹梧主編.急性中毒毒物檢測與診療.第1版.長沙：湖南科學技術出版社，2000.300-312.

8 辜轉(zhuǎn)榮，張玲.反相高效液相色譜法測定人血漿中佐匹克隆的濃度.中國藥師，2009，10：1398-1399.

9 陳新謙，金有豫主編.新編藥物學.第1版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002.208-209.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.03.055

050082 石家莊市，白求恩國際和平醫(yī)院檢驗實驗中心

R 916.62

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1002-7386(2014)03-0440-03

2013-09-18)