原發(fā)性小腸腺癌中PTEN蛋白及PCNA的表達(dá)及臨床意義

吳曉華 張莘 周文闊

·論著·

原發(fā)性小腸腺癌中PTEN蛋白及PCNA的表達(dá)及臨床意義

吳曉華 張莘 周文闊

目的 檢測PTEN蛋白和PCNA在原發(fā)性小腸腺癌組織、癌旁組織及正常小腸組織中的表達(dá)，探討其與原發(fā)性小腸腺癌的關(guān)系，為原發(fā)性小腸腺癌預(yù)后判斷提供依據(jù)。方法采用SP免疫組化法對(duì)32例小腸腺癌及其相應(yīng)癌旁組織、8例正常小腸組織進(jìn)行PTEN蛋白及PCNA的定位觀察。結(jié)果原發(fā)性小腸腺癌組織中PTEN蛋白陽性率為71.88%(23/32),相應(yīng)癌旁組織及正常小腸組織中PTEN蛋白未陽性率分別為15.63%(5/32)、2.50%(1/40)，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；原發(fā)性小腸腺癌組織中PTEN蛋白的表達(dá)與其分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。原發(fā)性小腸腺癌組織中PCNA陽性率為65.63%(21/32),相應(yīng)癌旁組織6.25%(2/32)及正常組織PCNA陽性率為2.50%(1/40)，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；原發(fā)性小腸腺癌組織中PCNA的表達(dá)與腫瘤部位、浸潤深度、分化程度相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論小腸腺癌中PTEN蛋白和PCNA的高表達(dá)可作為判斷預(yù)后的有效指標(biāo)，兩者聯(lián)合檢測可早期診斷小腸腺癌并判斷預(yù)后。

腺癌，小腸；免疫組織化學(xué) ；PTEN；增殖細(xì)胞核抗原；預(yù)后

PTEN抑癌基因?qū)δ[瘤的發(fā)生、發(fā)展起到重要作用，與腫瘤的侵襲和預(yù)后緊密相關(guān)，內(nèi)源性增殖細(xì)胞的標(biāo)記物增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)水平與腫瘤增殖有關(guān)。本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)，探討抑癌基因PTEN蛋白和PCNA在原發(fā)性小腸腺癌中的表達(dá)及其與原發(fā)性小腸腺癌發(fā)生、發(fā)展及臨床預(yù)后性指標(biāo)的關(guān)系，為判斷預(yù)后提供參考指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 標(biāo)本取自我院普通外科2004年4月至2007年10月手術(shù)切除的原發(fā)性小腸腺癌32例，術(shù)前均未行放、化療，男13例，女19例；年齡32～82歲，平均55.6歲。病變位于十二指腸22例，空腸4例，回腸6例；按小腸腺癌病理分化程度不同分高分化組9例、中分化組14例、低分化組9例。按淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移分淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例、無轉(zhuǎn)移12例。癌組織和癌旁組織分別制作病理切片3張，1張行HE染色重新病理確診，2張分別行PTEN和PCNA的免疫組化染色。取8例正常小腸組織蠟塊作為對(duì)照。均有完整隨訪資料。

1.2 試劑 鼠抗人PTEN單克隆抗體、鼠抗人增殖細(xì)胞核抗原單克隆抗體分別購自北京中山生物技術(shù)有限公司和上海瑞齊生物科技有限公司，ABC藥盒及試劑購自華美生物工程公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚4 μm。參照ABC法進(jìn)行免疫組化染色。PTEN陽性對(duì)照選用已知的乳腺癌標(biāo)本，PCNA陽性對(duì)照選用食管鱗癌標(biāo)本。陰性對(duì)照以PBS替代一抗。

1.4 結(jié)果判斷 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果采用半定量計(jì)數(shù)方法，由兩位病理科高年資醫(yī)師隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野進(jìn)行評(píng)判，PTEN蛋白和PCNA的陽性結(jié)果為細(xì)胞核棕褐色顆粒，具體計(jì)分方法為IRS=染色強(qiáng)度(SI)×陽性細(xì)胞百分比(PP)。SI分4個(gè)等級(jí)，0為陰性，1弱陽性，2中度陽性，3強(qiáng)陽性；PP分5個(gè)等級(jí)，0級(jí)為無陽性染色，1級(jí)為 10%，2級(jí)為10%～50%，3級(jí)為51%～80%，4級(jí)為80%以上。IRS結(jié)果在0～12分，積分在2分以上為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，生存曲線用Log-rank test，預(yù)后多因素分析應(yīng)用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 PTEN蛋白和PCNA的表達(dá) PTEN蛋白免疫組化染色陽性產(chǎn)物主要存在于細(xì)胞核，呈棕黃色或深褐色顆粒。32例小腸腺癌組織中PTEN 蛋白表達(dá)陽性率為71.88%(23/32)，對(duì)照切片陰性。癌旁組織及正常小腸組織分別為15.63%(5/32)、5.00%(2/40)。2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PCNA表達(dá)陽性率為65.63%(21/32)，癌旁組織及正常小腸組織分別為6.25%(2/32)、2.50%(1/40)，2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。低分化組PTEN 蛋白表達(dá)陽性66.7%(6/9),中分化組85.71%(12/14)及高分化組88.89%(8/9)，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而在不同性別、腫瘤大小、浸潤深度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) ，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的PTEN 蛋白表達(dá)80.00%(16/20)低于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組91.67%(11/12),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明PTEN基因的缺失導(dǎo)致PTEN 蛋白降低，致使小腸腺癌細(xì)胞的生長、分裂不受控制，脫離了正常生長調(diào)控狀態(tài)，癌細(xì)胞呈無節(jié)制的生長。小腸腺癌分化程度越低，PTEN蛋白表達(dá)越低，腫瘤的惡性度越高。PCNA表達(dá)陽性率為65.63%(21/32)，癌旁組織及正常小腸組織分別為6.25%(2/32)、2.50%(1/40)，2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。低分化組PCNA表達(dá)陽性率88.89%(8/9),中分化組71.43%(10/14),高分化組55.56%(5/9)，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而在不同性別、腫瘤大小、腫瘤部位、浸潤深度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的PCNA表達(dá)(15/20，75.00%)高于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組(7/12，58.33%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、2。

表1 小腸腺癌組織、癌旁組織及正常小腸組織PTEN蛋白和PCNA的表達(dá)比較 例(%)

表2 小腸腺癌組織PTEN蛋白和PCNA的表達(dá)影響因素分析 例(%)

2.2 PCNA和PTEN蛋白聯(lián)合表達(dá)情況與臨床病理學(xué)指標(biāo)和預(yù)后的關(guān)系 將小腸腺癌組織PCNA和PTEN蛋白表達(dá)結(jié)果進(jìn)行組合，PCNA (-)/PTEN (+)組多見于腫瘤中早期腫瘤(63.17 %，12/19)，PCNA(+)/PTEN(-)組多見于晚期腫瘤(71.43%，5/7)，且PCNA (-)/PTEN (+)組以無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為主(66.67%，10/15)，而PCNA(+)/PTEN(-)組以有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為主(71.43%，5/7)。PCNA (-)/PTEN (+)組5年生存率最高達(dá)70.6%，與其他各組兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0 01)，而PTEN蛋白陽性組及陰性組5年生存率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。表明聯(lián)合檢測PCNA和PTEN蛋白可進(jìn)一步明確小腸腺癌分期及判斷預(yù)后。

2.3 其他 將影響小腸腺癌患者預(yù)后的各種因素(性別、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PCNA表達(dá)、PTEN蛋白表達(dá)及4組不同PCNA和PTEN蛋白聯(lián)合表達(dá)情況)經(jīng)Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析，結(jié)果顯示影響小腸腺癌預(yù)后的因素主要為淋巴結(jié)有否轉(zhuǎn)移及PCNA /PTEN聯(lián)合表達(dá)情況(P<0. 01)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0. 01)和PCNA (-)/PTEN (+)(P<0. 01)預(yù)后較好，而其他指標(biāo)均未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

小腸約占胃腸道全長的75%，其黏膜總面積約占胃腸道表面積90%以上，但小腸腫瘤發(fā)病率低，約占胃腸道腫瘤的5%左右，惡性腫瘤發(fā)病率約占胃腸道惡性腫瘤的2%左右[1]。以腺癌及類癌最為常見，約占小腸惡性腫瘤的55%～80%。研究抑癌基因與PCNA對(duì)小腸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的影響的文章較多，但對(duì)抑癌基因PTEN和PCNA在小腸腺癌中的表達(dá)的研究國內(nèi)尚未見報(bào)道，我們應(yīng)用免疫組化方法檢測PTEN蛋白及PCNA，從分子水平探討小腸腺癌發(fā)生、發(fā)展的原因，尋找早期診斷小腸腺癌的方法，尋找判斷小腸腺癌預(yù)后的主要因素。PTEN是1997年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新抑癌基因[2]， PTEN蛋白含有一酪蛋白磷酸酶的功能區(qū)和約175個(gè)氨基酸與張力蛋白和輔助蛋白同源的區(qū)域。PTEN決定性的負(fù)性調(diào)節(jié)作用普遍存在于P13K信號(hào)通路中，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)換和調(diào)節(jié)生長、繁殖及存活信號(hào)[3]。許多癌基因的產(chǎn)物都是通過磷酸化而刺激細(xì)胞生長，PTEN基因通過其脂質(zhì)磷酸化酶活性使P IP3 去磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，阻止不受控制的細(xì)胞生長，參與細(xì)胞調(diào)控，從而限制腫瘤的形成。本研究中，PTEN蛋白表達(dá)陽性率為71.88%(23/32)，PTEN蛋白表達(dá)與小腸癌組織分化程度呈正相關(guān) (P<0.05)， 而與患者性別、年齡、腫瘤臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否和5年生存率無關(guān)(P>0.05) ，提示由于抑癌基因PTEN基因缺失，導(dǎo)致PTEN蛋白的丟失，從而使得小腸癌細(xì)胞原有的正常生長調(diào)控狀態(tài)發(fā)生紊亂，促使腫瘤細(xì)胞無節(jié)制的生長， PTEN蛋白越少，小腸腺癌細(xì)胞的分化程度就越低，其惡性度越高。檢測小腸腺癌組織抑癌基因PTEN蛋白的表達(dá)，有助于早期診斷小腸腺癌，并對(duì)小腸腺癌預(yù)后進(jìn)行更準(zhǔn)確的評(píng)估。

PCNA于1978年首次發(fā)現(xiàn)，是一種相對(duì)分子質(zhì)量為3.6×104的酸性核蛋白，共261 個(gè)氨基酸，其中酸性氨基酸明顯多于堿性氨基酸[4]。PCNA在DNA 鏈的損傷、修復(fù)、復(fù)制等環(huán)節(jié)中起關(guān)鍵作用，能夠加快DNA的合成速度。PCNA在細(xì)胞周期G2、M期最少，從G1 期開始合成，逐漸增加，S 期達(dá)到高峰[5]，其量的變化與和DNA 合成一致。PCNA 陽性表達(dá)的強(qiáng)弱直接反映了細(xì)胞增殖活動(dòng)的高低，是評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)，由于腫瘤細(xì)胞普遍具有旺盛的增殖能力，所以在許多腫瘤研究中顯示PCNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、惡性程度、分期及預(yù)后有關(guān)。大量研究表明，PCNA可作為組織癌變的一個(gè)標(biāo)記物，亦可作為臨床判斷腫瘤惡性程度的指標(biāo)[6]，PCNA高表達(dá)也是腫瘤預(yù)后不良的標(biāo)志。本研究中，PCNA在癌組織、癌旁及正常小腸組織中的表達(dá)表現(xiàn)為遞減，在低分化組、中分化組及高分化組中遞減。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(75.00%)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(58.33%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，本研究結(jié)果提示，PCNA表達(dá)越強(qiáng)，小腸腺癌細(xì)胞的增殖越不受控制，導(dǎo)致小腸腺癌的分化越差，淋巴結(jié)越易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后不良， PCNA可作為判斷小腸腺癌惡性程度及預(yù)后的有效指標(biāo)。在本研究中PCNA (-)/PTEN (+)組5年生存率最高達(dá)70.6%，明顯優(yōu)于單獨(dú)檢測PCNA和PTEN蛋白對(duì)預(yù)后的判斷。

綜上所述，小腸腺癌組織中PTEN蛋白表達(dá)與PCNA表達(dá)一致，但在小腸腺癌分化程度上表達(dá)相反，抑癌基因PTEN基因的缺失導(dǎo)致PTEN蛋白減少，促使小腸腺癌細(xì)胞的正常生長調(diào)控狀態(tài)出現(xiàn)紊亂并產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞無節(jié)制的生長， PTEN蛋白表達(dá)越減少，腫瘤 細(xì)胞的分化程度就越低，腫瘤的惡性度越高；而小腸腺癌分化越差，細(xì)胞凋亡減少，細(xì)胞增殖活動(dòng)明顯增強(qiáng)，所以PCNA表達(dá)越強(qiáng)，小腸腺癌的分化越差，越易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。我們推測抑癌基因PTEN的缺失及PCNA增多協(xié)同作用導(dǎo)致小腸腺癌惡性程度增高，預(yù)后不良，所以聯(lián)合檢測PTEN蛋白、PCNA可作為判斷腫瘤分級(jí)及預(yù)后的重要參考指標(biāo)。

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ExpressionofPTENproteinandPCNAinprimarysmallboweladenocarcinomaandSignificancy

WUXiaohua，ZHANGShen，ZHOUWenkuo.DepartmentofGeneralSurgery,TheFirstHospitalofQinhuangdao,Hebei,Qinhuangdao066000,China

adenearcinoma intestine，small；protein PTEN；proliferating cell nuclear antigen；immunohistochemistry;prediction

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.03.003

060000 河北省秦皇島市第一醫(yī)院普通外科

R 735.3

A

1002-7386(2014)03-0330-03

2013-09-11)

AbstrctObjectiveTo detect PTEN protein and proliferatingcell nuclear antigen(PCNA)in primary small bowel adencareinoma(SBAC) tissue，adjacent nontumorons tissue,and normal small bowel tissue,to investigate the relationship between the expression of tumor suppressor gene PTEN protein and PCNA and the biologcal behaviors of primary small bowel adencareinoma.MethodsExpression of PTEN protein and PCNA location were examined by streptavidin-peroxidase immunohistochemistry method in 32 SBAC，the corresponding adjacent nontumorons tissue and 8 normal small bowel tissues.ResultsExpression of PTEN protein was detected in 71.88% of the primary SBAC tissue，while expression in adjacent nontumorous tissue and normal small bowel tissue was detected in 15.63% and 12.50% (P<0.05)．The positive expression of PTEN was significantly related to the cell differentiation，diversion of ganglia lymphatica in primary SBAC tissue(P<0.05).Expression of PCNA was detected in 65.63% of the primary SBAC tissue. 6.25% of the adjacent nontumor tissue and 2.50% normal small bowel tissue(P<0.05)；The positive expression 0f PCNA was a significantly related to the tumor location，tumor infiltration depth and cell differentiation in primary SBAC tissue(P<0.05).ConclusionExpression of tumor suppressor gene PTEN and PCNA could be helpful in predicting the biological behavior and prognosis of primary SBAC．