蛋白激酶SPAK在海水淹溺性肺損傷中的表達(dá)和作用

李聰聰 薄麗艷 劉慶晴 劉 偉 金發(fā)光

淹溺每年造成了大量的人員傷亡，尤其以?xún)和颓嗌倌隇槎?，是亟待解決的公共安全問(wèn)題[1]。而在淹溺造成的損傷中尤其以海水淹溺為重，除直接造成受害者死亡外，還極易引起急性肺損傷(acute lung injury, ALI)[2]。目前的研究表明，海水造成的淹溺性肺損傷之所以比淡水嚴(yán)重，與其較高的滲透壓密切相關(guān)[2]。這也為海水淹溺性肺損傷指出了一個(gè)可能的研究方向。

STE20相關(guān)脯氨酸丙氨酸豐富的蛋白激酶(STE 20/SPS1-related praline/alaninerich kinase, SPAK)屬于STE20激酶家族，與細(xì)胞膜上的離子共同轉(zhuǎn)運(yùn)體相互作用，參與了鹽運(yùn)輸和滲透細(xì)胞體積的調(diào)控[3]。SPAK參與了細(xì)胞對(duì)滲透壓調(diào)節(jié)的信號(hào)傳導(dǎo)，在高滲刺激的情況下SPAK表達(dá)上調(diào)，繼而可以通過(guò)激活p38通路，從而參與高滲刺激時(shí)的炎癥反應(yīng)[4]。

本研究通過(guò)復(fù)制大鼠的海水淹溺性肺損傷(SWD/ALI)模型，觀察肺組織SPAK表達(dá)的變化，繼而探討SPAK的作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

抗SPAK39(Origene，美國(guó))，抗β-actin 單克隆抗體(安博，中國(guó))，RNA提取試劑盒(TIANGEN，北京)，TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒購(gòu)買(mǎi)于R&D。

配方海水按照中國(guó)國(guó)家海洋局第三海洋研究所海洋生化研究室提供的我國(guó)東南沿海海水的主要成分配制：NaCl 26.518 g/L，MgSO43.305 g/L，MgCl22.447 g/L，CaCl21.141 g/L，NaHCO30.202 g/L，KCl 0.725 g/L，NaBr 0.083 g/L；pH 8.2，相對(duì)密度1.05，滲透壓1300 mmol/L。

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性SD大鼠30只，清潔級(jí)，體質(zhì)量180～220 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物分為5組：對(duì)照組，海水處理1 h組，海水處理3 h組，海水處理6 h組，海水處理12 h組，每組6只。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.動(dòng)物模型的制備：用3%戊巴比妥鈉(1.5 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后將其仰臥固定，經(jīng)頸正中切口暴露氣管，取1 ml的注射器插入氣管，緩慢注入4ml/kg海水。大鼠在注入海水之后迅速出現(xiàn)呼吸加快，喘息，耳鼻發(fā)紺，全肺滿(mǎn)布濕啰音，有粉紅色泡沫液體從口鼻流出，表明海水淹溺肺損傷模型復(fù)制成功。在海水吸入后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)經(jīng)腹主動(dòng)脈放血處死大鼠，迅速取出肺組織。正常組麻醉后直接放血處死大鼠取肺。

2.肺組織病理檢測(cè)：取各組大鼠肺組織相同部位迅速放入4%多聚甲醛液中固定，脫水，石蠟包埋，切成5 μm厚的切片，然后用蘇木精-伊(hematoxylin-eosin, HE)染色，光學(xué)顯微鏡觀察。

3.肺組織濕干比(W/D)檢測(cè)：在吸入海水相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)放血處死大鼠，迅速取出各大鼠相同位置的肺組織，吸干表面的液體后在電子天平稱(chēng)取重量即為濕重。將肺組織置于70 ℃烘箱內(nèi)烘烤至恒重后秤取的重量即為干重。用濕重/干重計(jì)算所得即為濕干比，用以表示肺水腫嚴(yán)重程度。

4. ELISA檢測(cè)TNF-α和IL-1β：將適量肺組織加入PBS緩沖液，剪碎并用勻漿器將肺組織冰上充分勻漿，在4 ℃以離心半徑8 cm，3000 r/min離心20 min左右，收集上清液，然后按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

5.RT-PCR檢測(cè)SPAK mRNA表達(dá)：取100 mg肺組織加入1 ml Trizol，冰上充分勻漿裂解，用紫外分光度計(jì)定量，根據(jù)定量結(jié)果進(jìn)行反轉(zhuǎn)cDNA，-20 ℃保存。取適量的cDNA，加入Tap聚合酶，去離子水和引物進(jìn)行擴(kuò)增，以β-actin作為內(nèi)參照。SPAK上游引物5′ATGGCGGAGCCGAGCGGCTCG-3′，下游引物5′ TCAGCTCACACTCAACTGGGCGAAC-3′；β-actin上游引物5′ACGGTCAGGTCATCACTATCGG3′，下游引物5′GCACTGTGTTGGCATAGAGGTC3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s， 72 ℃ 7 min，最后4 ℃保存，其中變性，退火，延伸設(shè)置30個(gè)循環(huán)。

6.Western-blot檢測(cè)SPAK蛋白表達(dá)：取適量的肺組織，在事先準(zhǔn)備好的碎冰上剪碎肺組織，加入蛋白裂解液勻漿，離心收集上清，定量，沸水煮15 min，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，以半干轉(zhuǎn)膜的方式將電泳完成的聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)移到NC膜上。將已做好標(biāo)記的膜放入10%的脫脂奶粉封閉液中，于室溫緩慢振蕩2 h以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)；一抗以 1︰1000稀釋?zhuān)? ℃搖床震蕩過(guò)夜，TBST洗膜；加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔，37 ℃溫育2 h，再次TBST洗滌；將膜在暗室滴上發(fā)光液，避光保存并照相，結(jié)果做灰度掃描分析。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、肺組織濕干比

經(jīng)氣管海水灌注后，肺的W/D較正常組顯著升高，尤其以1 h為重。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，見(jiàn)表1。

表1 肺的濕干比檢測(cè)結(jié)果

二、肺組織的病理學(xué)改變

光學(xué)顯微鏡下見(jiàn)正常組肺組織，肺泡結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡腔未見(jiàn)明顯的炎細(xì)胞和液體滲出。海水淹溺組可見(jiàn)肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺泡壁增厚，肺泡腔被壓縮、變窄，有大量的炎細(xì)胞及液體的滲出，呈嚴(yán)重水腫，見(jiàn)圖1。

圖1 肺組織的病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果

三、海水淹溺對(duì)肺組織TNF-α和IL-1β的影響

海水淹溺3 h、6 h后與對(duì)照組相比，TNF-α和IL-1β的水平明顯增高(P<0.05)，隨后炎癥因子的表達(dá)開(kāi)始逐漸降低，見(jiàn)圖2。

注：**P<0.01,*P<0.05 vs. 正常組；# P<0.05, ##P<0.01 vs. 海水6 h組

四、海水淹溺對(duì)肺組織SPAK mRNA的影響

采用RT-PCR方法檢測(cè)肺組織中SPAK的mRNA含量變化，結(jié)果顯示海水刺激后肺組織中SPAK的mRNA含量明顯增加(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

五、海水淹溺對(duì)肺組織SPAK蛋白含量的影響

采用western blot方法檢測(cè)肺組織勻漿中的SPAK蛋白的含量，顯示海水淹溺組的SPAK蛋白含量比對(duì)照組顯著增高(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

注：**P<0.01,*P<0.05 vs. 正常組

討 論

高滲是海水淹溺主要的致傷因素，它可以通過(guò)在肺的血?dú)馄琳现行纬蓾舛忍荻?，從而使肺組織和微血管中的大量液體滲出到肺泡，形成嚴(yán)重的肺水腫[5-6]。此外海水的高滲可以作為一種刺激，對(duì)微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞內(nèi)某些蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)生影響，從而形成海水淹溺性肺損傷獨(dú)特的病理生理改變。如何發(fā)現(xiàn)這些獨(dú)特的改變，以及了解這些改變對(duì)人體產(chǎn)生的影響，并通過(guò)對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，從而阻止病情的進(jìn)一步發(fā)展有著重要的意義。

SPAK是STE20激酶家族的一個(gè)新的成員，它主要的生理作用是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上的離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，維持血壓的穩(wěn)定，它也是一個(gè)高血壓的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。現(xiàn)階段對(duì)SPAK的研究大部分集中在其對(duì)鈉鉀氯共同轉(zhuǎn)運(yùn)體(Na+-K+-2Cl-cotransporter, NKCC)磷酸化的調(diào)節(jié)[7]。在高滲或炎癥因子如TNF-α刺激下，SPAK表達(dá)升高，促進(jìn)NKCC的磷酸化。但是SPAK的作用并不止這些，它與炎癥的發(fā)生發(fā)展也有著密切的聯(lián)系。SPAK也可以通過(guò)激活p38通路，從而參與炎癥反應(yīng)[4]。在Crohn病等炎性腸病的研究中發(fā)現(xiàn)SPAK的表達(dá)同樣是升高的，通過(guò)siRNA干擾SPAK，可以降低腸上皮CaCo2-BEE細(xì)胞TNF-α, IL-1β, IL-17的分泌，從而降低組織的炎癥反應(yīng)[8]。而且siRNA干擾SPAK表達(dá)后，腸上皮的通透性可降低，表明SPAK對(duì)上皮細(xì)胞的屏障功能起調(diào)控作用[9]。有文獻(xiàn)報(bào)道SPAK的這種作用可能是通過(guò)對(duì)細(xì)胞間緊密連接蛋白Occludin表達(dá)的調(diào)控而起作用的。其下游的NKCC與上皮細(xì)胞的通透性也有聯(lián)系,有文獻(xiàn)稱(chēng)NKCC表達(dá)的升高可以使肺泡上皮細(xì)胞的通透性升高，從而加重肺損傷[7]。由此可見(jiàn)SPAK在炎癥及調(diào)節(jié)細(xì)胞的屏障功能中起著重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)顯示，在海水刺激后肺水腫及相關(guān)的炎癥因子明顯高于正常對(duì)照組。肺的濕干比以灌注后1 h為重，隨著時(shí)間的變化逐漸降低。而肺部的炎癥因子的含量則是逐漸升高，在3～6 h時(shí)達(dá)到頂峰。而后通過(guò)RT-PCR及western blot方法檢測(cè)肺組織勻漿中的SPAK含量的變化，提示在海水的刺激下，細(xì)胞通過(guò)上調(diào)SPAK的轉(zhuǎn)錄及翻譯來(lái)調(diào)節(jié)SPAK的含量及下游的相關(guān)分子的磷酸化，繼而加重肺的急性損傷。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)復(fù)制大鼠海水淹溺性肺損傷模型，表明在海水高滲透壓的刺激下，細(xì)胞通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯上調(diào)SPAK的表達(dá)，參與肺的炎癥反應(yīng)，加重了急性肺損傷的程度。本研究的結(jié)果指出了新的海水淹溺性肺損傷產(chǎn)生的機(jī)制，但是其確切的作用有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

參 考 文 獻(xiàn)

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