Isthmin對(duì)博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化小鼠膠原沉積及血管生成的影響

楊雪梅 陳魁君 謝 芳 王建民

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一組以肺泡上皮損傷、肺實(shí)質(zhì)彌漫性炎性浸潤、成纖維細(xì)胞異常增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積為主要特征的一大組疾病，目前發(fā)病機(jī)制仍不清楚，缺乏特效治療手段，預(yù)后很差[1]。有研究認(rèn)為促纖維化/抗纖維化因子失調(diào)以及促炎/抗炎因子失調(diào)在特發(fā)性肺纖維化中起重要作用。然而針對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor, TGF-β1)、干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等抑制促纖維化/促炎因子以減輕肺纖維化的措施被證明效果不佳[2-3]。機(jī)制不清楚。

Isthmin(ISM)最早是從后腦組織中鑒定出的一種相對(duì)分子量為60×103的分泌性蛋白，最初被證實(shí)與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)，在腦、肺等臟器中均有表達(dá)[4-5]。我們?cè)谇捌诘膶?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Isthmin蛋白在肺纖維化模型小鼠中表達(dá)降低，且小鼠對(duì)10 μg/kg劑量的重組Isthmin蛋白耐受性較好，可能在肺纖維化的病理進(jìn)程中發(fā)揮了作用。本實(shí)驗(yàn)采用博來霉素(bleconmycin, BLM)復(fù)制小鼠肺纖維化模型，應(yīng)用重組Isthmin蛋白進(jìn)行干預(yù)，觀察肺纖維化程度、膠原沉積、血管生成等，旨在探討Isthmin蛋白是否可能作為防治肺纖維化新的治療靶標(biāo)。

材料與方法

一、 實(shí)驗(yàn)材料

昆明小鼠由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重30±2.5 g；重組小鼠Isthmin蛋白(貨號(hào)：577502，BioLegend公司)；鹽酸博來霉素(日本化藥株式會(huì)社，批號(hào)：H20055883)；CD31抗體(貨號(hào)：CBL1337，BD BioSciences公司)；免疫組化試劑盒(博士德生物工程有限公司，貨號(hào)：SA1022)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 肺纖維化模型復(fù)制方法：實(shí)驗(yàn)小鼠用4%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰臥固定于操作板，消毒頸部皮膚并做一小切口，逐層分離暴露氣管，由氣管軟骨間隙進(jìn)針，沿向心方向緩慢注入博來霉素溶液5 mg/kg或等體積生理鹽水(0.9%NS)，氣管注藥完畢后立即將動(dòng)物置于直立體位，并左右旋轉(zhuǎn)，使藥液盡量均勻分布于肺內(nèi)，逐層縫合手術(shù)切口[6]。

2. 分組：取健康的昆明小鼠48只隨機(jī)分為三組，每組16只：對(duì)照組(氣管內(nèi)注射0.9%NS+尾靜脈注入0.9%NS)、模型組(氣管內(nèi)注射BLM+尾靜脈注入0.9%NS)、ISM組(氣管內(nèi)注射BLM+尾靜脈注入ISM蛋白)。在手術(shù)后0 h、24 h、48 h對(duì)照組及模型組分別由尾靜脈注入0.9%NS 60 μl，ISM組則注入ISM蛋白10 μg/kg。手術(shù)后分別于第7、14、21、28天各取4只小鼠肺組織進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

3. 標(biāo)本采集及肺組織病理學(xué)觀察：小鼠腹腔麻醉、局部消毒后沿胸骨剪開胸壁，充分暴露胸腔，觀察大體病理變化。右心室插管，以10%甲醛行肺血管灌注，至左心房流出液顏色澄清后，結(jié)扎氣管，游離雙肺，取右肺石蠟包埋切片。行常規(guī)蘇木精-伊紅染色(HE)、Masson染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。血管數(shù)目采用CD31免疫組化染色法，CD31抗體濃度為1︰100。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

4. 圖像分析：應(yīng)用Image-Pro Plus6.0對(duì)圖像進(jìn)行處理。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行分析，自動(dòng)計(jì)算光密度值，平均光密度值用于各組間比較。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、肺大體病理觀察

對(duì)照組小鼠除第一周肺組織輕度腫脹，其余時(shí)間點(diǎn)肺表面呈粉紅色，肉眼未見病變。模型組小鼠各時(shí)間點(diǎn)肺表面均可見散在點(diǎn)狀至片狀暗紅色病變，以下肺尤其右下肺為多。ISM組各時(shí)間點(diǎn)亦可見表面散在點(diǎn)狀至片狀暗紅色病變，但與模型組比較，病變數(shù)目相對(duì)較少，病變面積也較小。

二、病理組織學(xué)改變

對(duì)照組在第7天可見部分肺泡壁有少量炎細(xì)胞浸潤，大部分肺泡壁正常，肺泡腔無縮小，在第14天、21天、28天，肺泡壁炎細(xì)胞浸潤消失，肺部未見明顯病理改變。模型組在第7天即可見大量炎細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，第14天炎癥最為顯著，21天及28天見炎細(xì)胞浸潤逐漸減輕，但肺泡壁增厚，肺泡腔縮小，纖維細(xì)胞數(shù)目增多。ISM組的病理表現(xiàn)與模型組相似，但無論第7天的炎細(xì)胞浸潤還是隨后各時(shí)間點(diǎn)的肺泡間隔增寬程度均較模型組輕，肺泡間隔中纖維細(xì)胞數(shù)目也較模型組少，見圖1。

三、ISM對(duì)肺組織膠原表達(dá)的影響

膠原纖維經(jīng)Masson染色在光鏡下呈藍(lán)色。正常肺組織肺泡間隔膠原纖維較少，而纖維化的肺組織肺泡間隔見大量膠原纖維沉積。通過對(duì)各時(shí)間點(diǎn)肺組織Masson染色圖片比較可見在早期炎癥階段，膠原沉積開始增加，在后期的纖維化階段，大量膠原纖維沉積，肺泡間隔幾乎被藍(lán)色膠原纖維充填。而在Isthmin蛋白干預(yù)后，雖然在第7天及14天的炎癥階段，肺組織膠原沉積與模型組差別不大，但在自21 d以后的纖維化階段，肺泡間隔中膠原沉積較模型組明顯減少，見圖2。經(jīng)圖像分析，模型組各時(shí)間點(diǎn)膠原沉積較對(duì)照組顯著增加(P<0.01)。Isthmin干預(yù)組與模型組比較，第21天、28天膠原沉積顯著降低(P<0.01)。表明Isthmin蛋白可降低博來霉素引起的膠原表達(dá)增加，見表1。

四、ISM對(duì)肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的影響：

在對(duì)照組，血管內(nèi)皮細(xì)胞在肺泡壁散在分布，數(shù)量較少，著色較淺。模型組血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞呈棕染較深，與對(duì)照組相比，差異顯著(P<0.05)。Isthmin蛋白干預(yù)后，在后期肺纖維化階段，血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目顯著增加(P<0.05)，見圖3、表2。

表1 肺組織膠原纖維Masson染色MOD值比較

表2 肺組織CD31蛋白MOD值比較

圖1 各組肺組織不同時(shí)間病理變化(×200)

圖2 肺組織Masson染色(×200)

注：內(nèi)皮細(xì)胞染色陽性，呈棕色改變。對(duì)照組(NS+NS)；模型組(BLM+NS)；Isthmin干預(yù)組(BLM+ISM)

討 論

肺纖維化是呼吸系統(tǒng)難治性疾病之一，以成纖維細(xì)胞增殖和大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM) 聚集為主要特征的病變。由于肺間質(zhì)的廣泛纖維化，使肺順應(yīng)性降低，肺容量減少，彌散功能降低，通氣/血流比例失調(diào)。臨床表現(xiàn)為刺激性干咳、無痰、進(jìn)行性的呼吸困難及活動(dòng)后明顯加重等。病程一般呈進(jìn)行性發(fā)展，最終可以引起呼吸功能衰竭而死亡，其5年生存率不超過50%，因此目前引起許多國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[7-10]。但迄今肺纖維化的病因及其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。

近年來血管生成在肺纖維化發(fā)生中的作用日益受到重視。新近的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，血管生成活性的增加歸咎于促血管生成和抗血管生成的失衡，促血管生成因素增加，肺纖維化模型新生血管增多與博萊霉素誘發(fā)的肺纖維化密切相關(guān)。這些研究表明異常的血管重構(gòu)可能在IPF的發(fā)生中起重要作用。我們的研究也證實(shí)肺纖維化模型小鼠的肺組織確實(shí)存在肺血管內(nèi)皮數(shù)目增多，提示血管生成增加[3, 11-12]。血管生成的異常增加可能參與了肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程。

Isthmin蛋白的中部具有凝血栓蛋白的type 1重復(fù)序列(thrombospondin type 1 repeat)，C末段具有黏附相關(guān)蛋白區(qū)域，TSR在分泌性或跨膜性蛋白中存在，其功能與細(xì)胞黏附、通訊和組織重建相關(guān)[4, 13]。Isthmin蛋白是一種血管生成抑制分子，可以負(fù)反饋的調(diào)節(jié)VEGF 誘導(dǎo)的血管生成，在體外具有誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、抑制新生血管形成的作用[5, 14-15]。本研究用Isthmin蛋白注入肺纖維化模型小鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示在一定程度上減輕了肺纖維化早期的炎癥反應(yīng)及肺纖維化后期的膠原沉積， 尤其以減少膠原沉積的作用最為顯著，表明Isthmin蛋白對(duì)肺纖維化有一定的防治作用。根據(jù)目前對(duì)Isthmin蛋白功能的研究結(jié)果，推測(cè)Isthmin蛋白抑制肺纖維化的進(jìn)展可能與抑制血管生成有關(guān)。出乎意料的是，肺組織血管內(nèi)皮染色卻顯示注入Isthmin蛋白后，與注射生理鹽水比較，模型小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目不僅沒有減少，反倒有所增加。這提示Isthmin蛋白抑制肺纖維化形成的作用可能不是通過抑制血管生成的途徑實(shí)現(xiàn)的。本研究關(guān)于Isthmin蛋白的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)并沒有如文獻(xiàn)報(bào)道的體外實(shí)驗(yàn)一樣，有抑制血管生成的作用，提示Isthmin蛋白還具有除抑制血管生成之外的其他作用。其具體的細(xì)胞分子機(jī)制有待更深入的研究。無論Isthmin蛋白的具體作用機(jī)制如何，在我們的實(shí)驗(yàn)中，它確實(shí)具有減輕博來霉素刺激產(chǎn)生肺纖維化病情程度的作用，可望成為防治肺纖維化的新藥物。

參 考 文 獻(xiàn)

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